1. Оценка антимикробной активности
ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы, связанные с бактериями, должны проводиться в стерильных условиях, чтобы избежать загрязнения как анализа, так и лаборатории. Перед использованием все среды должны быть подвергнуты автоклавной обработке, а пластиковая посуда и оборудование, такое как пипетки, должны содержаться в стерильных условиях. Рекомендуется проводить работы в биозащитном колпаке (тип 2).
- Нанесите запасы глицерина штаммов бактерий, подходящих для антибиотика, на лизогенный бульонный агар (LB, приготовленный в соответствии с инструкциями производителя) и вырастите их в течение ночи при температуре 37 °C.
заметка: Выбор бактерий для проверки антибактериальной активности должен быть сделан на основе используемого антибиотика. Следует выбрать репрезентативный диапазон из 5–10 бактерий из видов, которые, как известно, чувствительны к антибиотику, с учетом логистических возможностей лаборатории. По возможности также следует проверить устойчивость к бактериям. Приведенный ниже протокол будет работать на большинстве бактерий, но проверьте, требуются ли особые условия (например, CO2, специальные среды) и при необходимости внесите изменения. Бактерии, успешно проанализированные с использованием этих условий, включают стафилококки, стрептококки, бациллы, кишечную палочку, клебсиеллу пневмонию, синегнойную палочку и энтерококк фециум.
- Выберите одну колонию из планшета и закваливайте в течение ночи 5 мл катионированного бульона Мюллера-Хинтона (CAMHB, приготовленный в соответствии с инструкциями производителя) при температуре 37 °C.
- Развести ночные культуры в ~40 раз в CAMHB и вырастить до среднелогарифмической фазы, оптическая плотность при 600 нм (OD600) = 0,4–0,8, объем 5 мл).
- Приготовьте исходные растворы каждого флуоресцентного антибиотика в концентрации 1,28 мг/мл в стерильной воде и пипеткой внесите 10 мкл антибиотика в первую колонку 96-луночного планшета.
- Добавьте 90 μL CAMHB в первую колонну и 50 μL во все остальные лунки. Затем выполните последовательное 2-кратное разведение по пластине.
- Тщательно перемешайте, затем разбавьте культуры средней фазы до ~106 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл и добавьте 50 мкл во все лунки, чтобы получить конечную концентрацию ~5 x 105 КОЕ/мл.
объем культуры (мл) = (объем среды в мл)/(наружный диаметр600 x 1 000)
Например, для наружного диаметра600 = 0,5 культуры в желаемом объеме среды 12 мл добавьте (12/(0,5 x 1,000) = 0,024 мл культуры к 12 мл среды
- Накройте пластины крышками и выдерживайте при температуре 37 °C в течение 18–24 ч, не встряхивая.
- Визуально осмотрите пластины, причем MIC является лункой с самой низкой концентрацией и без видимого роста.
заметка: В таблице 1 приведены некоторые примеры активных и неактивных флуоресцентных антибиотиков.
2. Анализ накопления зонда методом спектрофотометрии
ПРИМЕЧАНИЕ: Это время центрифугирования было оптимизировано для E. coli, поэтому для других видов могут потребоваться небольшие изменения. Представлены репрезентативные данные по накоплению зонда для зонда с NBD-меченным ципрофлоксацином.
- Нанесите запасы глицерина бактериальных штаммов на LB-агар и вырастите их в течение ночи при 37 °C.
- Выберите одну колонию из тарелки и заведите культуру на ночь в LB при 37 °C.
- Разбавляют ночные культуры в среде в ~50 раз и выращивают до среднелогарифмической фазы (наружный диаметр600 = 0,4–0,8).
- Центрифугируйте культуры при давлении 1 470 x g в течение 25 минут и сцеживайте среду.
- Ресуспендируйте бактерии в 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), затем центрифугируйте при 1470 x g в течение 15 минут.
- Сцедите фильтрующий материал и повторно суспендируйте промытые гранулы в PBS до конечного наружного диаметра600 = 2.
- При желании добавьте 10,1 мкл карбонилцианида 3-хлорфенилгидразона (CCCP, 10 мМ в PBS) на 1 мл бактерий (конечная концентрация 100 мкМ) и инкубируйте при 37 °C в течение 10 мин.<бр/>
заметка: CCCP является ингибитором насоса оттока. Добавление CCCP позволит изучить влияние оттока.
- Центрифугируйте культуры при давлении 18 000 x g в течение 4 минут при 20 °C и сцеживайте среду.
- Добавьте в гранулу 1 мл флуоресцентного раствора антибиотика (10–100 мкМ в PBS) и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
- Центрифугируйте культуры при давлении 18 000 x g в течение 7 минут при 4 °C и сцеживайте среду.
- Восстановите бактерии в 1 мл холодной PBS и повторите шаг 2.9.
- Повторите шаг 2.10 в общей сложности 4 раза.
- При желании лизизируйте бактерии, добавив 180 мкл лизисного буфера (20 мМ Tris-HCl, pH 8,0 и 2 мМ натрия ЭДТА), а затем 70 мкл лизоцима (72 мг/мл в H2O).
- Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут, затем заморозить-разморозить 3 раза (−78 °C в течение 5 минут, затем 34 °C в течение 15 минут).
- Обрабатывайте образцы ультразвуком в течение 20 минут, затем нагревайте до 65 °C в течение 30 минут.
- Центрифугируйте лизированные образцы (18 000 x g, 8 мин), затем отфильтруйте через фильтрующую мембрану с температурой 10 кДа.
- Промойте фильтр 4x 100 μл воды.
- Перенесите лизат на 96-луночный планшет с плоским дном и измерьте интенсивность флуоресценции на планшетном ридере с длинами волн возбуждения и излучения, соответствующими флуорофору (т.е. 7-(диметиламино)-2-оксо-2H-хромен-4-ил [DMACA]: λex = 400 нм, λem = 490 нм; нитробензоксадиазол [NBD]: λex = 475 нм, λem = 545 нм).
заметка: На рисунке 1 приведены примеры спектрофотометрического анализа бактерий с использованием флуоресцентного антибиотика ципрофлоксацина, меченного NBD.
