Выделение инвариантных естественных киллеров Т-клеток из мышиной модели

Аннотация

Источник: Meng, M., et al. Адоптивная иммунотерапия клеток iNKT у мышей с глюкозо-6-фосфатизомеразой (G6PI)-индуцированным РА.J. Vis. Exp.(2020)

Это видео иллюстрирует метод выделения инвариантных естественных киллерных Т-клеток, также известных как клетки iNKT. Процедура начинается с введения мыши синтетического гликолипида для стимуляции активации и пролиферации клеток iNKT в селезенке. Затем из селезенки получают суспензии одиночных клеток и инкубируют с iNKT-клеточными узнавающими комплексами, меченными флуорофорами, с последующим разделением на основе магнитных шариков для выделения клеток iNKT.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Получение инвариантных естественных киллеров Т-клеток (iNKT клеток) с помощью адоптивной клеточной терапии

1. Направленная индукция ячеек iNKT
   1. Нормальным мышам внутрибрюшинно вводят α-галактозилцерамид (α-GalCer) (0,1 мг/кг массы тела).
2. Выделение ячеек iNKT
   1. Через три дня после моделирования мышам внутрибрюшинно вводят 1% пентобарбитал натрия (50 мг/кг массы тела) для обезболивания. Мыши, находящиеся под адекватной анестезией, не демонстрируют реакцию оттягивания задней лапы на щипец пальца ноги.
   2. Изолируйте селезенку мыши DBA/1 после внутрибрюшинной инъекции α-GalCer. Приготовьте одноклеточную суспензию, разрезав и измельчив селезенку в сите с 200 мешами.
   3. Промойте клеточную суспензию фосфатно-соевым буфером (PBS), центрифугируйте при 200 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Повторять.
   4. Ресуспендируйте клетки 1 мл цельной крови и раствора для разведения тканей. Добавьте 3 мл среды для разделения лимфоцитов мыши, затем центрифугируйте клетки в течение 20 мин при 300 x g при комнатной температуре.
   5. Соберите слой молочно-белых лимфоцитов (т.е. второй слой сверху), промойте его 2 раза с помощью PBS и посчитайте с помощью автоматического счетчика клеток.
3. Магнитно-активированная сортировка клеток (MACS) стратегия положительного отбора для очистки клеток iNKT
   заметка: Для предварительной обработки тетрамеров CD1d 1 мг/мл α-Гальцера разбавляли до 200 мкг/мл 0,5% Tween-20 и 0,9% NaCl, а к 100 мкл раствора тетрамера CD1d добавляли 5 мкл полученного раствора. Смесь инкубировали в течение 12 ч при комнатной температуре и помещали при температуре 4 °C для использования. Т-клеточный рецептор (TCR) β разбавляли в 80 раз деионизированной водой. Все остальные антитела использовали в качестве исходного раствора.
   1. Ресуспендируйте 10⁷ клеток 100 мкл 4 °C PBS, добавьте 10 мкл CD1d-тетрамер-фикоэритрина, загруженного α-GalCer (CD1d Tetramer-PE), и инкубируйте их при 4 °C в течение 15 мин в темноте.
   2. Промойте клетки 2 раза PBS и повторно суспендируйте их в 80 мкл PBS.
   3. Добавьте 20 μL анти-PE-MicroBeads и инкубируйте их при 4 °C в течение 20 минут в темноте.
   4. Промойте их 2 раза PBS и повторно суспендируйте клетки 500 μл PBS.
   5. Поместите сортировочную колонну в магнитное поле сортировщика MACS и промойте 500 мкл PBS.
   6. Добавьте суспензию ячеек из шага 1.3.4 в сортировочную колонку, соберите проточный поток и промойте 3 раза буфером PBS.
   7. Снимите магнитное поле и соберите ячейки с сортировочной колонны. На этом этапе добавьте 1 мл буфера PBS в сортировочную колонну и быстро нажмите на поршень при постоянном давлении, чтобы направить меченые ячейки в сборную трубку и получить очищенные ячейки iNKT. Подсчет с помощью автоматического счетчика ячеек.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Анти-PE Микрогранулы	Милтеньи	Тел.: 130-048-801	Германия
Столбцы	Милтеньи	госпожа	Германия
Криогенная центрифуга	Бэкмен	Аллегра® Х-15Р	Америка
Мышь CD1d Tetramer-PE	МБЛ	ТС-МЦД-1	Япония
Мышь перколл	Соларбио	П8620	Китай
оптический микроскоп	Олимп	Олимп-II	Япония