Усиление вирусной трансдукции в естественных клетках-киллерах с помощью катионного полимера

Аннотация

Источник: Нанбахш, А., и др. Дексон повышает эффективность лентивирусной трансдукции первичных NK-клеток мыши и человека. J. vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует анализ катионной полимер-опосредованной вирусной трансдукции в естественных киллерах (NK) клетках. Клетки инкубируются с трансгенными лентивирусными векторами, кодирующими флуоресцентный белок. Добавление катионного полимера позволяет вирусу прикрепляться к клеткам и интегрировать свою РНК в геном хозяина, экспрессируя флуоресцентный белок. Флуоресценцию количественно оценивают для оценки индуцированного полимером усиления трансдукции.

Протокол

1. Трансдукция мышиных и человеческих первичных NK-клеток лентивирусом

1. Суспензируйте первичные NK-клетки мыши или человека в 24-луночный планшет при концентрации 0,5 × 10⁵/мл среды в присутствии супернатанта лентивируса зеленого флуоресцентного белка (GFP) при 5, 10 и 20 кратности инфекции (MOI) и в присутствии Pb (8 мкг/мл), PS (8 мкг/мл) или декстрана (8 мкг/мл).
2. Центрифугируйте планшеты при давлении 1 000 × г в течение 60 минут.
3. Не сцеживая надосадочную жидкость, культивировать клетки в течение ночи (16-18 ч) в инкубаторе при температуре 37 °C, наполненном 5,2%_CO2.
4. Промойте 10 мл PBS и повторно суспендируйте в 2 мл полной питательной среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 в присутствии интерлейкина 2 (IL-2, 300 ЕД/мл).
5. Соберите трансдуцированные NK-клетки на 7-й день, осторожно постукивая по колбам.
   1. Активируйте собранные клетки титруемыми концентрациями связанного с пластинами антиприродного киллера группы 2D (NKG2D) (A10) mAb путем покрытия 96-луночных полистирольных пластин с высокой абсорбцией белка концентрацией 2,5 мкг/мл анти-NKG2D mAb в течение ночи.
   2. Промойте каждую лунку 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) три раза перед добавлением первичных NK-клеток.
6. Соберите супернатанты культур с помощью многоканальной пипетки в период от 16 до 18 ч после активации для количественного определения цитокинов, таких как интерферон-гамма (ИФН-γ). Построение стандартных кривых с использованием рекомбинантных цитокинов, поставляемых с наборами иммуноферментного анализа (ИФА).
7. Проверить жизнеспособность NK-клеток с помощью окрашивания аннексином-V/7-амино-актиномицином D (7-AAD) и определить процент некротических клеток среди трансформированных NK-клеток с помощью проточного цитометра.
   1. Для проведения этого анализа соберите мышиные и человеческие NK-клетки через четыре дня после трансдукции, промойте два раза 10 мл холодной PBS по 500 × г в течение 5 минут и инкубируйте с набором Аннексин-V (ПЭ)/7-AAD.
8. Используйте соответствующее программное обеспечение для проточной цитометрии для анализа данных. Выберите популяцию живых клеток и проанализируйте экспрессию GFP (канал флуоресцеина изотиоцианата [FITC]) в качестве меры вирусной трансдукции.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
декстран	Сигма-Олдрич	90-64-91-9
Полибрен (Pb)	Сигма-Олдрич	ТР-1003
Сульфат протамина (ФС)	Сигма-Олдрич	Стр3369
RPMI1640	Корнинг	10-040-CV
Интерферон гамма (ИФН-γ )	eBioscience	Тел.: 14-7311-85
Раствор для окрашивания лодида пропидиума	БД	51-66211Э
Липофектамин 3000	Термо Фишер	L3000015
Изофлуран	феникс	НДЦ 57319-559-05
Элементы 293T	АТКС	КРЛ-3216
Колбы Т75	Корнинг	430641У
Наборы ИФА	Эбионаука	00-4201-56 (Английский)