Трансфекция первичных макрофагов модифицированной мРНК

Аннотация

Источник: Herb, M. et al., Высокоэффективная трансфекция первичных макрофагов с помощью транскрибированной мРНК in vitro. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует процесс трансфекции первичных макрофагов модифицированной мРНК, кодирующей зеленый флуоресцентный белок. Эти модифицированные мРНК, предназначенные для снижения иммуногенности и улучшения ее стабильности, обеспечивают успешную трансфекцию и последующую экспрессию зеленых флуоресцентных белков, что подтверждается с помощью флуоресцентной микроскопии.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все шаги в перчатках. Проводите все этапы трансфекции под ламинарным проточным колпаком, чтобы предотвратить загрязнение клеток. Перед началом работы с мРНК очистите все инструменты, такие как пипетки, и все поверхности 70% этанолом и/или поверхностно-активным веществом, разрушающим РНКазу (Таблица материалов). Убедитесь, что все реакционные пробирки не содержат РНКазы и стерильны. Для разведения используйте только стерильную воду, не содержащую РНКазы. Используйте исключительно наконечники для пипеток с фильтрами. Меняйте наконечники пипеток после каждого этапа пипетирования.

1. Генерация матрицы ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Матрица ДНК для транскрипции мРНК in vitro с использованием этого протокола должна содержать промоторную последовательность T7, чтобы обеспечить стыковку РНК-полимеразы. Если плазмида, содержащая последовательность ДНК представляющего интерес белка, уже содержит правильно ориентированную промоторную последовательность Т7 непосредственно перед представляющей интерес последовательностью, необходимо провести линеаризацию плазмиды (см. шаг 1.1). В противном случае присоедините промотор Т7 к интересующей последовательности методом полимеразной цепной реакции (ПЦР, см. шаг 1.2).

1. Линеаризация плазмид, содержащих промотор Т7
   1. Линеаризуйте плазмиды, уже содержащие правильно ориентированную промоторную последовательность Т7, путем расщепления с помощью фермента рестрикции, разрезающего стоп-кодон интересующей последовательности. В противном случае транскрипция не завершится должным образом после интересующей последовательности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего использовать ферменты рестрикции, оставляя тупые концы или выступы 5 футов.
   2. Подтвердите полную линеаризацию плазмиды с помощью электрофореза в агарозном геле непереваренной и переваренной плазмидной ДНК.
   3. Очистите линеаризованную плазмидную ДНК перед использованием в качестве матрицы ДНК для транскрипции мРНК in vitro с помощью набора для очистки ДНК (Таблица материалов).
2. Присоединение промотора Т7 методом ПЦР
   1. Используйте прямой праймер, содержащий следующие компоненты (в указанном порядке от 5' до 3'): около 5 случайных.н. до промотора (например, GAAAT); последовательность промотора T7 (TAATACGACTCACTATAG); два дополнительных Gs для повышения эффективности транскрипции (GG); специфичную для последовательности мишени, которая гомологична плазмидной последовательности, окружающей стартовый кодон.
      заметка: Он должен состоять из 3-6.о. до последовательности KOZAK и стартового кодона, последовательности KOZAK и стартового кодона (обычно GCCACC ATG G), 12-18.о. ниже стартового кодона. Если интересующая последовательность еще не содержит последовательность KOZAK или стартовый кодон, они могут быть присоединены на этом этапе, просто включив их в последовательность праймера.
   2. Рассчитывайте t_m прямого праймера только с учетом части, гомологичной целевой последовательности.
   3. Для оценки образования димеров/шпилек используйте всю последовательность праймеров, которая легко может превышать 50.н.
   4. Используйте обратный праймер, расположенный где-то ниже по течению от стоп-кодона.
      Примечание: Если интересующая последовательность еще не содержит стоп-кодона, его можно присоединить на этом этапе, просто включив его в последовательность праймера.
   5. С помощью прямого и обратного праймеров выполните ПЦР с использованием высокоточной полимеразы с корректурой (Таблица материалов).
   6. Подтвердите получение одного продукта и размера ампликона с помощью электрофореза в агарозном геле (например, используйте 1% агарозный гель и постоянный ток 100 В).
   7. Очистите продукт ПЦР перед использованием в качестве матрицы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) для транскрипции in vitro матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) с помощью набора для очистки ДНК.

2. Генерация мРНК

1. Разморозьте все компоненты набора для транскрипции мРНК in vitro (см. Таблицу материалов). Вихрь в течение 5 с и вращение вниз в течение 2 с при 2 000 x g. Держите на льду до использования.
2. Приготовьте реакционную смесь для транскрипции мРНК in vitro в микроцентрифужной пробирке объемом 0,5 мл в следующем порядке (общий объем 40 мкл): 20 мкл 10-кратной смеси аналогов с обратным колпачком/нуклеозидтрифосфата (ARCA/NTP) (входит в набор для транскрипции мРНК in vitro); 0,25 мкл 5-метил-цитидинтрифосфата (5-mCTP) (конечная концентрация (f.c.) 1,25 мМ; 50% от общего CTP); 0,25 мкл псевдо-уридинтрифосфата (псевдо-UTP) (f.c. равна 1,25) миллиметр; 50% от общего объема УТП); X мкл матрицы ДНК; 2 мкл смеси РНК-полимеразы Т7 (входит в набор для транскрипции мРНК in vitro); Y мкл свободной от РНКазы H₂O.
   ПРИМЕЧАНИЕ: X – это объем, содержащий не менее 1 мкг ДНК. Например, 1,6 мкл из исходного раствора с концентрацией 625 нг/мкл. Y – запасной объем к общему объему 40 μл.
3. Вихрь в течение 5 с и вращение вниз в течение 2 с при 2 000 x g. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин при 400 об/мин в термомиксере для транскрипции in vitro.
4. Затем добавьте 2 мкл DNase I непосредственно в реакционную смесь для удаления матричной ДНК. Вихрь в течение 5 с и вращение вниз в течение 2 с при 2 000 x g.
5. Инкубировать при температуре 37 °C в течение 15 минут при 400 об/мин на термомиксере. Возьмите аликвоту 2 мкл для контрольного геля (шаг 3.3) и храните при температуре -80 °C.
6. Для поли(А)-хвоста добавьте следующие компоненты непосредственно в предыдущую реакционную смесь (до конечного объема 50 мкл): 5 мкл 10-кратного реакционного буфера поли(А)-полимеразы и 5 мкл поли(А)-полимеразы (оба включены в набор для транскрипции мРНК in vitro). Вихрь в течение 5 с и вращение вниз в течение 2 с при 2 000 x g.
7. Инкубируйте смесь при 37 °C в течение 30 минут при 400 об/мин на термомиксере. Возьмите аликвоту 2 мкл для контрольного геля (шаг 3.3) и храните при температуре -80 °C.
8. Для дефосфорилирования 5'-концов мРНК добавляют следующие компоненты непосредственно в предыдущую реакционную смесь (до конечного объема 60 мкл): 3 мкл свободной от РНК H₂O; 6 мкл 10-кратного реакционного буфера антарктической фосфатазы; 3 мкл антарктической фосфатазы (15 единиц на 60 мкл реакционного объема). Вихрь в течение 5 с и вращение вниз в течение 2 с при 2 000 x g.
9. Инкубируйте смесь при температуре 37 °C в течение 30 минут при 400 об/мин на термомиксере.
10. Инактивация антарктической фосфатазы путем инкубации при 80 °C в течение 2 мин.<бр/> заметка: В идеале использовать отдельный термомиксер, не ждать, пока первый миксер наберет нужную температуру.

3. Очистка мРНК

1. Очистите транскрибируемую in vitro мРНК с помощью специального набора для очистки РНК (Таблица материалов).
   1. Добавьте X мкл элюирующего раствора в реакционную смесь мРНК с этапа 2.10. Перемешайте, перевернув 5 раз. Добавьте 300 μл концентрата связующего раствора. Перемешайте с помощью щадящей пипетки 5 раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: X - это запасной объем до общего объема 100 μL. Например, добавьте 40 мкл элюирующего раствора к 60 мкл мРНК-реакционной смеси.
   2. Добавьте 100 мкл этанола, не содержащего РНКазы. Перемешайте с помощью щадящей пипетки 5 раз.
   3. Поместите фильтрующую колонку в одну из прилагаемых сборных пробирок. Аккуратно перенесите смесь мРНК на центр фильтра, не касаясь фильтра. Центрифуга при 15 000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре (RT).
   4. Осторожно поднимите фильтрующую колонну и выбросьте проточный поток в сборную трубку. Поместите фильтрующую колонку обратно в ту же сборную трубку.
   5. Добавьте 500 мкл раствора для стирки (не забудьте добавить 20 мл этанола, не содержащего РНКазы, перед первым использованием раствора для стирки).
   6. Центрифугируйте при 15 000 x g в течение 1 минуты при RT. Повторите шаги 3.1.4-3.1.6 для мытья еще раз.
   7. Центрифугируйте на полной скорости (17 900 x g) в течение 1 минуты при RT, чтобы удалить остатки жидкости из фильтрующей колонны. Осторожно выньте фильтрующую колонку из сборной трубки. Поместите колонку фильтра в новую пробирку для сбора.
   8. Добавьте 50 μL элюирующего буфера в центр фильтра, не касаясь фильтра. Выдерживать при температуре 65 °C в течение 10 минут на термомиксере.
   9. Центрифугируйте при 15 000 x g в течение 1 минуты при RT. Снимите фильтрующую колонку и выбросьте ее.
2. Измерьте концентрацию и чистоту элюированной мРНК, например, с помощью микрообъемного спектрофотометра для измерения поглощения при 260 и 280 нм.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение A260/A280 1,8-2,1 указывает на высокоочищенную мРНК.
3. Проверьте наличие одного продукта, правильную длину транскрипта и поли(А) хвостообразование путем анализа аликвот из этапов 2.5 и 2.7 с помощью электрофореза в агарозном геле в условиях денатурации (например, используйте 1,2% агарозный гель, содержащий 20 мМ 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты [MOPS], 5 мМ ацетата натрия, 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 20% формальдегида, и запустите в 20 мМ MOPS, 5 мМ ацетата натрия, 1 мМ ЭДТА и 0,74 % формальдегида при постоянном токе 100 В).
4. Храните очищенную мРНК в элюирующей пробирке при температуре -80 °C до трансфекции. Если использовать только небольшое количество мРНК для трансфекции, то аликвотировать мРНК, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: мРНК можно хранить при температуре -80 °C около 1 года.

4. Получение макрофагов

1. Усыпить мышей C57/BL6 (использовать мышей того же пола в возрасте от 6 до 24 недель) при вывихе шейки матки.
   Примечание: Те же мыши могут быть использованы для выделения первичных макрофагов (PM) (шаг 4.2) и генерации BMDM (шаги 4.3 и 4.4). Для выделения ТЧ используют не менее двух мышей. Если нужно создать только BMDM, обычно достаточно одной мыши.
2. Иммуномагнитное обогащение перитонеальных макрофагов.
   1. Наполните шприц объемом 10 мл канюлей 0,9 x 40 мм 8 мл ледяного фосфатно-солевого буфера (PBS) и 2 мл воздуха. Промойте брюшную полость с помощью PBS. В воздухе образуется пузырь, который сводит к минимуму утечку PBS.
   2. Быстро соберите перитонеальный лаваж тем же шприцем и переложите его в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл. При необходимости объедините перитонеальные клетки нескольких мышей. Держите клеточную суспензию на льду.
   3. Центрифужную суспензию клеток при 650 х г в течение 5 мин при 4 °С. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную таблетку в 5 мл 0,2 % NaCl на 30 с для лизиса эритроцитов.
   4. Добавьте 5 мл 1,6% NaCl к общему объему 10 мл для восстановления изотонических условий. Центрифугируйте при 650 x g в течение 5 мин при 4 °C.
   5. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 97,5 мкл буфера для магнитной сортировки клеток (MCS) (2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты [ЭДТА], 0,5% бычьего сывороточного альбумина [БСА] в PBS) на 1 перитонеальный лаваж (например, если три мыши были промыты, ресуспендируйте в 292,5 мкл).
   6. Добавьте 2,5 мкл парамагнитных шариков, конъюгированных с CD11b-специфическим антителом на 97,5 мкл клеточной суспензии (например, добавьте 7,5 мкл к 292,5 мкл).
   7. Инкубируйте на льду в течение 15 минут при 150 об/мин на орбитальном вибростенде.
   8. Центрифужируйте клеточную суспензию при 650 x g в течение 5 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл буфера MCS.
   9. Добавьте 4 мл буфера MCS в общий объем 5 мл и промойте клетки, осторожно пипетируя вверх и вниз три раза.
   10. Повторите шаги 4.2.8 и 4.2.9 еще два раза, всего три этапа стирки.
   11. На этапах промывки поместите колонку LS в магнитный сепаратор ячеек (см. Таблицу материалов). Промойте колонку 3 мл буфера MCS.
       заметка: Избегайте пузырьков, так как они могут засорить колонку.
   12. Ресуспендируйте клеточную таблетку в 1 мл буфера MCS. Добавьте 3 мл буфера MCS в общий объем 4 мл и перемешайте с помощью пипетирования вверх и вниз три раза.
   13. Перенесите 4 мл клеточной суспензии на промытую колонку LS.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Опять же, избегайте пузырей, так как они могут засорить колонку.
   14. Дождитесь, пока резервуар колонны полностью опустеет. Не добавляйте дополнительную жидкость до тех пор, пока колонка не перестанет капать.
   15. Добавьте в столбец 3 мл буфера MCS. Затем, дождитесь, пока резервуар колонны полностью опустеет. Повторите шаг 4.2.15 еще два раза.
   16. Поместите колонку LS в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Нанесите на колонку 5 мл буфера MCS. Подождите, пока 2 мл жидкости пройдет через колонку, затем с помощью поршня аккуратно протолкните оставшуюся фракцию в трубку.
   17. Центрифужируйте суспензию клеток при 650 х г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
   18. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) с добавлением 10% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) (DMEM+FCS).
   19. Определение количества жизнеспособных клеток путем подсчета в растворе трипанового синего в счетной камере Нейбауэра и затравочных клеток в DMEM+FCS в культуральных планшетах.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Высевайте PM при плотности 100 000 клеток/лунку в микротитровальной пластине с плоским дном. Не используйте планшеты, обработанные тканевыми культурами, так как PM не может быть отделен от них. Вместо этого используйте необработанные пластины.
3. Генерация BMDM
   1. Удалите кожу и мышцы с задних лап с помощью ножниц. Вымойте каждую ногу путем кратковременного погружения в 70% этанол.
   2. Отсоедините ножки и раскройте оба конца бедренной и большеберцовой костей, разрезав ножницами.
   3. Наполните шприц объемом 5 мл, заполненный канюлей размером 0,6 мм x 30 мм, 5 мл очень низкого уровня эндотоксина (VLE) RPMI 1640 и промойте костный мозг из вскрытых костей в чашке для посева.
   4. При необходимости объедините костный мозг нескольких мышей, повторив шаги 4.3.1-4.3.3. Переложите костный мозг в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
   5. Центрифугируйте суспензию костного мозга при 650 х г в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
   6. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 5 мл буфера для лизиса эритроцитов (8,3% хлорида аммония, NH₄Cl, 0,1 М Трис) и инкубируйте в течение 5 мин в ЛТ для лизирования эритроцитов.
   7. Центрифугируйте клеточную суспензию при 650 х г при 4°С в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
   8. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды VLE Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 с добавлением 10% FCS, 1% пенициллина/стрептомицина, 1% HEPES, 1% пирувата натрия и 10 нг/мл рекомбинантного макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF) (RPMI+++++).
   9. Добавьте 4 мл RPMI+++++ к общему объему 5 мл.
   10. Приготовьте 5 необработанных чашек Петри размером 92 мм x 16 мм с кулачками (см. Таблицу материалов) на каждую мышь, впрыскивая в каждую чашку 7 мл RPMI+++++ среды.
   11. Переложите 1 мл клеточного раствора в 5 приготовленных культуральных чашах и инкубируйте при 37 °C и 5% CO₂.
   12. Через 4 дня подкормите клетки, добавив 4 мл RPMI+++++. Через 6-7 дней клетки костного мозга полностью дифференцируются в МВДМ.
4. Заготовка БМДМ
   1. Полностью удалите среду из посуды для культуры. Добавьте в каждое блюдо по 5 мл теплой 0,2 мМ ЭДТА в PBS.
   2. Аккуратно соскребите всю пластину ячеистым скребком, чтобы отсоединить BMDM. Соедините суспензии клеток в конической центрифужной пробирке объемом 50 мл.
   3. Снова смыть все 5 тарелок. Используйте один и тот же объем 5 мл теплой 0,2 мМ ЭДТА в PBS для всех 5 блюд. Совместите эту клеточную суспензию с той, что была на предыдущем шаге.
   4. Центрифугируйте клеточную суспензию при 650 х г в течение 5 мин при 4°С и выбросьте надосадочную жидкость.
   5. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды VLE RPMI 1640 с добавлением 10% FCS, 1% HEPES, 1% пирувата натрия и 10 нг/мл рекомбинантного M-CSF, но без антибиотиков (RPMI⁺⁺++).
   6. Определение количества жизнеспособных клеток путем подсчета в растворе трипанового синего в счетной камере Нойбауэра и затравочных клеток в RPMI⁺⁺++ в культуральных планшетах.
      заметка: Затравите BMDM при плотности 50 000 клеток/лунка максимум в микротитровальной пластине с плоским дном. Не используйте планшеты, обработанные тканевыми культурами, так как от них трудно отделить BMDM. Вместо этого используйте необработанные пластины.

5. Трансфекция макрофагов мРНК

1. Рассчитать необходимый объем буфера для трансфекции мРНК.
   заметка: Требуемый объем буфера для трансфекции мРНК зависит от размера лунки: используйте 200 мкл для трансфекции в 6-луночном планшете, 100 μл в 12-луночном планшете и так далее. Всегда добавляйте немного свободного объема из-за потери при пипетировании (но не слишком много, чтобы предотвратить чрезмерное разведение мРНК). Например, используйте 450 мкл вместо 4 x 100 мкл = 400 мкл для трансфекции в 4 лунки 12-луночного планшета.
2. Рассчитайте необходимый объем реагента для трансфекции мРНК. Реагент для трансфекции мРНК добавляется в соотношении 1:50. Например, для конечного объема в 450 мкл требуется 9 мкл реагента для трансфекции мРНК.
3. Рассчитайте общее необходимое количество мРНК. Для эффективной трансфекции требуется не менее 100 нг на 100 000 макрофагов, 200 нг работает еще лучше (например, 800 нг мРНК для трансфекции 400 000 макрофагов).
   1. Умножьте расчетное количество необходимой мРНК на общее количество лунок, которые должны быть трансфицированы (например, 4 лунки с 400 000 макрофагов в каждой: 4 x 800 нг = 3 200 нг мРНК требуется всего для всех лунок). Например, если ваш запас мРНК составляет 426,8 нг/мкл, 7,49 мкл необходимо для оптимальной трансфекции 4 лунок с 400 000 макрофагов в каждой.
4. Добавьте рассчитанный объем буфера для трансфекции мРНК (шаг 5.1.) за вычетом объемов реагента для трансфекции мРНК (шаг 5.2) и мРНК (шаг 5.3) в реакционную пробирку. Например, 450 μL - 9 μL - 7,49 μL = 433,51 μL.
5. Разморозьте запас мРНК и перемешайте его, осторожно перевернув пробирку для элюирования. Добавьте рассчитанный объем мРНК (шаг 5.3) в реакционную пробирку с реакционным буфером мРНК (в представленном выше примере: 7,49 мкл в 433,51 мкл).
6. Вихрь в течение 5 с и вращение вниз в течение 2 с при 2 000 x g.
7. Вортексируйте реагент для трансфекции мРНК в течение 5 с и вращайте вниз в течение 2 с при 2000 x g.
8. Добавьте рассчитанный объем реагента для трансфекции мРНК (шаг 5.2) в реакционную пробирку, содержащую буфер для трансфекции мРНК и мРНК (в представленном выше примере: 9 мкл реагента для трансфекции мРНК).
9. Переваривайте трансфекционную смесь в течение 5 с и вращайте вниз в течение 2 с при давлении 2 000 x g.
10. Инкубировать в течение 15 минут при RT.
11. Тем временем замените питательную среду макрофагов свежей, теплой питательной средой (см. шаги 4.2.18 и 4.4.5).
12. После стадии инкубации 5.10 добавьте трансфекционную смесь в лунки, содержащие макрофаги, в объеме, соответствующем размеру лунки (см. шаг 5.1). Добавьте трансфекционную смесь по каплям по кругу от наружной стороны до середины лунки.
13. Аккуратно покачивайте пластину, сначала в вертикальном, а затем в горизонтальном направлении, чтобы обеспечить равномерное распределение трансфекционной смеси в лунке. Затем инкубируйте при 37 °C и 5 %_CO2. Синтез белка, кодируемого трансфицированной мРНК, начнется вскоре после трансфекции. Для достижения наилучших результатов инкубируйте не менее 6 часов.
14. После инкубации проанализируйте эффективность трансфекции с помощью (иммуно)флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии или иммуноблоттинга или используйте трансфицированные макрофаги для эксперимента по выбору.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
5-метил-CTP (100 мМ)	Биозиенс в Йене	НУ-1138С	хранить при -20 °C
Антарктическая фосфатаза	Биолаборатории Новой Англии	М0289	хранить при -20 °C
Реакционный буфер антарктической фосфатазы (10X)	Биолаборатории Новой Англии	В0289	хранить при -20 °C
антитела к NEMO/IKKγ	Инвитроген	МА1-41046	хранить при -20 °C
антитела к β-актину	Сигма-Олдрич	А2228	хранить при -20 °C
Чашки Петри 92,16 мм с кулачками	Сарштедт	8 21 473	хранится в RT
CD11b Микрогранулы мыши и человека	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-049-601	хранить при температуре 4 °C
Cre рекомбиназа + T7-Promotor форвардный праймер	Сигма-Олдрич		5′-GAAATTAATACGACTCACTA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3', хранить при -20 °C
Рекомбиназа Cre + Обратный праймер T7-Promotor	Сигма-Олдрич		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, хранить при -20 °C
Набор для очистки ДНК: QIAquick PCR Purification Kit	Цягэн	No 28104	хранится в RT
eGFP + T7-Promotor форвард-праймер	Сигма-Олдрич		5'-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3', хранить при -20 °C
Обратный праймер eGFP + T7-Promotor	Сигма-Олдрич		5'-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3', хранить при -20 °C
Буфер Fast Digest (10X)	Термо Сайентиал	В64	хранить при -20 °C
ФастДайджест XbaI	Термо Сайентиал	ФД0684	хранить при -20 °C
Высокоточная полимераза с корректурой: Q5 High Fidelity DNA-Polymerase	Новая Англия Биолабс Инк	М0491С	хранить при -20 °C
IKKβ + T7-Promotor форвард-праймер	Сигма-Олдрич		5′-GAAATTAATACGACTCACTA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, хранить при температуре -20 °C
Обратный праймер IKKβ + T7-Promotor	Сигма-Олдрич		5'-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3', хранящийся при -20 °C
набор для транскрипции мРНК in vitro: набор мРНК HiScribe T7 ARCA (с хвостовым оперением polyA)	Биолаборатории Новой Англии	Е2060	хранить при -20 °C
Колонны LS	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-042-401	хранится в RT
MACS MultiStand	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-042-303	хранится в RT
Буфер и реагент для трансфекции мРНК: jetMESSENGER	Трансфекция Polyplus	409-0001ДЭ	хранить при температуре 4 °C
Мутантная плазмида IKKβ IKK-2S177/181E	Адджен	11105	хранить при -20 °C
Мутантная плазмида NEMOC54/347A	Адджен	No 27268	хранить при -20 °C
Плазмида pEGFP-N3	Адджен	62043	хранить при -20 °C
Поли(I:C)	Кальбиохим	528906	хранить при -20 °C
Плазмида pPGK-Cre			Ф. Т. Вундерлих, Х. Вильднер, К. Раевский, Ф. Эденхофер, Новые варианты индуцируемой Cre-рекомбиназы: Новый мутант гибридного белка Cre-PR демонстрирует повышенную чувствительность и расширенный диапазон индуцируемости. Нуклеиновые кислоты Res. 29, 47e (2001). хранить при -20 °C
Псевдо-УТП (100 мМ)	Биозиенс в Йене	НУ-1139С	хранить при -20 °C
Сепаратор QuadroMACS	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-090-976	хранится в RT
Антитело CD11b к мышам крысы, конъюгированное с APC	Биолегенда	101212	хранить при температуре 4 °C
Антитело F4/80 против мыши крысы, конъюгированное с ПЭ	eBioscience	12-4801-82	хранить при температуре 4 °C
рекомбинантный M-CSF	Пепротех	315-02	хранить при -20 °C
Набор для очистки РНК: набор для очистки транскрипции MEGAclear	ThermoFisher Scientific	АМ1908	хранить при температуре 4 °C
РНКазе-разрушающее поверхностно-активное вещество: RnaseZAP	Сигма-Олдрич	Р2020	хранится в RT
Сверхчистый ЛПС из E.coli O111:B4	Инвивоген		хранить при -20 °C
Плазмида дикого типа IKKβ	Адджен	11103	хранить при -20 °C
Плазмида NEMO дикого типа	Адджен	No 27268	хранить при -20 °C