ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол описывает необходимые шаги для элиминации конкретных клеток с помощью фотоиммунотерапии в ближнем инфракрасном диапазоне (NIR-PIT). Контроль и другие подробности о NIR-PIT и жизнеспособности клеток можно найти в другом месте.
1. Конъюгация инфракрасного 700 (IR700) с моноклональными антителами (mAb)
- Приготовьте интересующий вас мАТ в концентрации 2-5 мг/мл в 0,1 М растворе динатриягидрофосфата (Na2HPO4) (pH 8,6).
- Смешать 6,8 нмоль мАт с 30,8 нмоль 10 мМ IR700 в 0,1 М Na2HPO4 растворе (рН 8,6) в микроцентрифужной пробирке и инкубировать при ОТ в течение 1 ч, накрыв алюминиевой фольгой.
- Промойте колонку PD-10 (см. Таблицу материалов/оборудования) 15 мл PBS дважды. Загрузите образец из шага 1.2.
- Очистите смесь с помощью колонки PD-10 с помощью элюирования PBS в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь элюирование происходило по цвету полосы IR700. Для образца объемом 300 мкл фракция элюирования PBS обычно составляет от 2,5 мл до 4,4 мл.
- Определяют концентрацию белка с помощью окрашивания Кумасси, измеряя поглощение на длине волны 595 нм с помощью спектрофотометра. Определите концентрацию IR700 с абсорбцией на длине волны 689 нм для подтверждения количества молекул флуорофора, конъюгированных с каждой молекулой mAb.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно определить оптимальное число конъюгации молекул IR700 в 1 мАт с помощью спектрофотометра. Как правило, около 3 молекул IR700 в 1 молекуле mAb является оптимальным для работы как in vitro, так и in vivo. Высокоэффективные методы жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) могут быть использованы для подтверждения того, связаны ли mAb и IR700.
- Хранить при температуре 4 °C после определения концентрации белка.
2. Приготовление смешанной 3D клеточной культуры (смешанный сфероид)
- Нанесите стерильную воду (около 1 мл) в секцию резервуара пластины подвесных капельных пластин.
- Получить различные соотношения интересующих типов клеток — клеток A431-люциферазы-зеленого флуоресцентного белка (A431-luc-GFP) и клеток 3T3-красного флуоресцентного белка (3T3-RFP) — с каждым образцом, содержащим в общей сложности 5000 клеток, суспендированных в 50 мкл питательных сред.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте соотношения 1:100, 10:100, 25:100, 50:100 и т.д. типов клеток, представляющих интерес в питательных средах, в зависимости от типа клеток.
- Инкубируйте смесь в течение 5-7 дней в 96 луночно подвешенной поддоне в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C и 5% углекислого газа. Меняйте питательные среды каждые 2 дня. ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы точно изготовить 3D-сфероид, обращайтесь с пластиной осторожно, так как капли, содержащие клетки, легко отпадают, прежде чем сформировать 3D-формы.
- Наблюдайте за морфологией и размерами сфероидов с помощью инвертированного светлопольного микроскопа с 10-40-кратным увеличением. ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это зависит от типа клеток и размера висячей капли, убедитесь, что диаметр сфероида составляет около 400-600 мкм после 7 дней инкубации в 96-луночной подвесной пластине.
3. In vitro NIR-PIT для смешанной 3D клеточной культуры
- Смените среду подвесных планшетов на среду, содержащую конъюгат антитело-фотоабсорбер (APC) с конъюгатом антитело-фотоабсорбер (APC) в течение 6 часов, и инкубируйте в течение 6 часов во влажном инкубаторе при 37 °C и 5% углекислом газе.
- После 6-часовой инкубации сфероид дважды промойте свежей питательной средой (фенол красный без фенола). Аккуратно перенесите сфероид в чашку со стеклянным дном диаметром 50 мм со 100 мкл свежей свободной питательной среды фенолового красного цвета с помощью стерильного наконечника пипетки объемом 200 мкл с отрезанным кончиком. Поместите по одному сфероиду в каждую посуду.
- Наблюдайте за сфероидом с помощью инвертированного светлопольного микроскопа, чтобы обнаружить изменение морфологии. Для наблюдения оптических репортеров (например, GFP и RFP) используйте флуоресцентный микроскоп со следующими настройками фильтра: GFP — фильтр возбуждения 469 нм и фильтр излучения 525 нм; RFP — фильтр возбуждения 559 нм и эмиссионный фильтр 630 нм.
- Поместите светодиод (LED) над чашкой со стеклянным дном для облучения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сфероиды могут подвергаться воздействию ближнего ИК-диапазона как на микроскопе, так и в ламинарном колпаке.
- Измерьте плотность мощности ближнего ИК-излучения с помощью измерителя оптической мощности. Согласно этому измерению, излучение ближнего ИК-излучения осуществляется с помощью светоизлучающих диодов (LED), которые излучают свет с длинами волн от 670 до 710 нм со скоростью 2 Дж/см2,<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Светодиодный свет может проникать на максимальную глубину около 5 дюймов. Цитотоксические эффекты БИК-ПИТ зависят только от заданной энергии, независимо от плотности мощности и продолжительности воздействия.
- После облучения сфероид переложить в новую подвесную пластину с 50 мкл свежей питательной среды и инкубировать в течение 1 суток в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C и 5% углекислого газа.
- Осторожно перенесите сфероид в чашку со стеклянным дном со 100 мкл свежей питательной среды (без фенола) с помощью стерильного наконечника пипетки объемом 200 мкл с отрезанным кончиком. Наблюдайте за сфероидом с помощью флуоресцентного микроскопа через 1 день после NIR-PIT с настройками фильтра, описанными в шаге 3.3.
- Обнаружение мертвых клеток путем добавления йодида пропидия в среду в конечной концентрации 2 мкг/мл или путем потери цитоплазматической GFP-флуоресценции с помощью флуоресцентного микроскопа (рис. 1B).
- Повторите шаги 3.1-3.6, если целевые клетки не устранены полностью.
