Выделение гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для создания иммунной системы мышей

Аннотация

Источник: Lanis, J. M., et al. Тестирование иммунотерапии рака на гуманизированной мышиной модели с опухолями человека. J. Vis. Exp. (2022)

Это видео демонстрирует метод создания мышей иммунной системы человека (HIS). CD34⁺ гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) выделяют из клеток охристой оболочки пуповинной крови человека с помощью магнитных шариков, покрытых антителами. CD34⁺ ГСК размножаются в питательной среде, обогащенной цитокинами и криоконсервированной. Наконец, размороженные ГСК вводят иммунодефицитному мышонку для создания мышиной модели ГИС.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB. Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Поколение мышей HIS

1. Мышиное разведение мышей BALB/c -Rag2^null Il2RγC^null Sirpα^NOD (BRGS) мышей
   заметка: Этот штамм крайне иммунодефицитен, в нем отсутствуют Т, В или естественные киллеры (NK). Поэтому необходимо применять строгие меры для предотвращения оппортунистических инфекций. Поддерживайте колонию на диете, содержащей триметоприм и сульфадиазин, чередуя 2-недельный график с обычным питанием. Поддерживайте максимально возможный уровень предосторожности в комнате для проживания (например, барьерное душевое помещение с ограниченным доступом).
   1. Поддерживайте колонии гомозиготных мышей BALB/c -Rag2^null Il2RγC^null Sirpα^NOD (BRGS) и BALB/c Rag2^null Il2RγC^null Sirpa^Balb/c (BRG).
   2. Разведение BRGS^N/N×BRG^B/B для получения щенков BRGS^B/N, которые будут использоваться в качестве реципиентов стволовых клеток человека. В этой колонии BRGS^B/N более здоровы, чем BRGS^N/N, и приживаются на эквивалентных уровнях (больше, чем BRG).
2. Выделение CD34+ стволовых клеток человека из пуповинной крови (КБ)
   заметка: Для этой процедуры не используются антибиотики. Поэтому хорошая стерильная техника просто необходима.
   1. Поместите штатив для конических пробирок объемом 50 мл, а также 3 конические пробирки объемом 15 мл и ~10 конических пробирок объемом 50 мл в стерилизованный шкаф биобезопасности (БСК). Сбрызните мешок для сбора крови 70% этанолом и дайте ему высохнуть в BSC.
   2. Рассчитайте количество конических пробирок объемом 50 мл, необходимых для изоляции градиента плотности CB = объем CB/15, округленные в большую сторону и до четного числа пробирок. Рассчитайте объем крови в пробирке = объем/количество пробирок CB. Осторожно налейте кровь из пакета CB в каждую коническую пробирку; это максимум 15 мл на пробирку. С помощью автоматической пипетки и серологической пипетки объемом 25 мл смешайте кровь в соотношении 1:1 со стерильным PBS путем пипетирования вверх и вниз.
   3. Используйте автоматическую пипетку на низкой скорости и серологическую пипетку объемом 10 мл для медленного подпитывания крови раствором градиента плотности комнатной температуры (ОТ) 1,077 г/мл (см. Таблицу материалов), не нарушая границу раздела. Следите за тем, чтобы наконечник пипетки не касался дна трубки. Повторите для всех трубок. Затем центрифугируйте в течение 30 минут при давлении 850 x g, без торможения, в режиме RT, чтобы обеспечить поддержание градиента плотности.
   4. Визуализируйте ячеистую оболочку поверх градиента плотности 1,077 г/мл в виде мутного белого слоя. Удалите и сбросьте слой плазмы на глубину примерно до 10 мл над охристым слоем с помощью серологической пипетки объемом 25 мл и автоматического пипеттора.
   5. Соберите охристую шерсть с помощью стерильного переноса или серологической пипетки. Используйте пипетку как шпатель, чтобы соскребать клетки со стороны конической трубки, отпуская колбу (или медленно выполняя пипетирование), чтобы извлечь клетки вверх. Соедините охристые слои из двух конических пробирок объемом 50 мл в одну новую коническую пробирку объемом 50 мл.
   6. Промойте клетки, налив в каждую коническую пробирку 45 мл стерильного сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS), содержащего 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Центрифуга в течение 11 мин при 360 x g при RT.
   7. Отсасывайте промывочный материал до гранул во всех пробирках. Используйте серологическую пипетку объемом 10 мл и автоматическую пипетку для ресуспендирования первой гранулы в 10 мл HBSS, содержащей 2% FBS. Повторно суспендируйте каждую гранулу в тех же 10 мл HBSS и промойте каждую пробирку еще 10 мл HBSS, чтобы собрать все клетки в одну пробирку.
   8. Налейте в коническую пробирку 45 мл стерильного HBSS, содержащего 2% FBS. Центрифуга в течение 10 мин при 360 x g, при 4 °C.
   9. Отасуньте промывочный буфер до клеточной гранулы и повторно суспендируйте гранулу в 20 мл магнитного буфера сепаратора ячеек (см. Таблицу материалов). Снимите небольшую аликвоту для подсчета клеток гемацитометром в разведении 1:20 в метиленовом синем. Добавляем количество синих и белых клеток. Центрифуга при 360 x g, в течение 10 мин при 4 °C.
      заметка: В этом протоколе используется технология магнитных шариков (см. Таблицу материалов). Протокол может быть модифицирован для использования с любой технологией разделения клеток, с достаточной чистотой и выходом стволовых клеток CD34+.
   10. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу CD34+, выделенную из пуповинной крови, в 300 мкл магнитного буфера-сепаратора клеток на 1 x 10⁸ клеток. Сначала добавьте 100 мкл реагента, блокирующего Fc-рецептор (FcR), а затем 100 мкл магнитных гранул CD34+ на 1 x 10⁸ клеток. Инкубировать при температуре 4 °C в течение 30 минут (без льда).
   11. Добавьте 5 мл буфера для магнитного сепаратора на 1 x 10⁸ элементов и вращайте при 360 x g в течение 10 минут при 4 °C. Повторите этап промывки и повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл буфера магнитного сепаратора на 1 x 10⁸ элементов в конической пробирке объемом 15 мл с маркировкой «нефракционированный».
   12. Промаркируйте еще две конические пробирки объемом 15 мл "CD34-" и "CD34+". Поместите три конические пробирки объемом 15 мл (нефракционированные, CD34- и CD34+) в пазы A1, B1 и C1 соответственно на охлаждающей решетке (см. Таблицу материалов). Разделите ячейки с помощью двухколоночной программы положительного отбора на автоматическом магнитном сепараторе ячеек (см. Таблицу материалов) в ДСК в соответствии с инструкциями производителя по прибору.
3. Наращивание и замораживание CD34+ стволовых клеток человека
   1. Аликвот 10 мкл восстановленной суспензии клеток CD34+ (2 мл) на предметное стекло гемоцитометра и подсчитайте клетки при 10-кратном увеличении. Рассчитайте общее количество клеток CD34+, умножив количество клеток на 2 x 10⁴. Разделите общее число клеток CD34+ на 250 000, чтобы рассчитать количество флаконов для замораживания (50 000 клеток на детеныша мыши до расширения in vitro).
   2. Приготовьте 10% фетальную телячью сыворотку (FCS) от CB Iscove (плюс 1 мл дополнительно для потери фильтрации), дополненную фактором стволовых клеток 40 нг/мл, 20 нг/мл FMS-подобной тирозинкиназы 3 (Flt3L) и 10 нг/мл интерлейкина-6 (IL-6), и пропустите через фильтр 0,22 мкм. Ресуспендируйте CD34+ клетки при концентрации 100 000 на мл CB-среды и инкубируйте при 37 °C. На 3-й день добавьте эквивалентный объем среды КБ без цитокинов в колбу, содержащую клетки, и среду КБ с цитокинами.
      заметка: Добавление этих цитокинов в среду CB способствует выживанию и размножению CD34+ клеток, предотвращая при этом дифференцировку.
   3. Соберите расширенные клетки CD34+ на 5-й день. Пипеткой наведите клеточную суспензию вверх и вниз и соберите в коническую пробирку объемом 50 мл. Добавьте достаточное количество среды CB, чтобы покрыть дно колбы. С помощью скребка для ячеек соскребите все дно колбы. Соберите все среды в одну пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при 360 x g в течение 11 минут.
   4. Ресуспендируйте клетки в 2 мл среды CB. Сохраните последнюю каплю из пипетки в 96-луночный планшет для подсчета. Разведите клетки в соотношении 1:1 в трипановом синем и добавьте 10 мкл в гемацитометр, затем подсчитайте и усредните клетки из четырех квадрантов. Рассчитайте общее количество клеток CD34+, умножив количество клеток на 4 x 10⁴, и запишите жизнеспособность.
   5. Внесите n+1 мл замораживающей среды, где n — количество замораживающих флаконов, рассчитанное на шаге 1.3.1. Приготовьте замораживающую среду, добавив 10% (v/v) диметилсульфоксида (ДМСО) в FBS, и держите на льду. Пометьте криовиалы CB#, CD34+ d5 и датой.
   6. Раскрутите CD34+ клетки при 360 x g в течение 10 минут при 4 °C. Отсасывайте среду до гранулы и повторно суспендируйте клеточную гранулу в замораживающей среде. Внесите 1 мл клеточной суспензии в каждый флакон и остатки равномерно разделите между флаконами. Добавьте флаконы в морозильную камеру с изопропанолом, охлажденную до 4 °C, поместите при температуре -80 °C и переложите в жидкий азот для хранения в течение >90 дней.
4. Облучение детенышей мышей
   1. Соберите щенков BRGS^B/N через 1-3 дня после рождения в автоклавный пластиковый ящик с набивкой. Добавьте небольшое количество подстилки вместе со щенками. Пометьте коробку номером клетки и количеством щенков.
   2. Установите облучатель (см. Таблицу материалов) на дозу 300 рад. Установите коробку с детенышами в облучатель и подвергните их воздействию 300 рад. Отведите щенков обратно в клетку, сложите их в кучу и накройте подстилкой.
5. Инъекции Pup и препарирование клеток CD34+
   1. Начните подготовку клеток CD34+ через ~3 ч после облучения. Нагрейте 10 мл CB среды в конической пробирке объемом 50 мл. Выполняйте все шаги в стерильной ДСК.
   2. Извлекайте один флакон экстракционных и замороженных CD34+ клеток in vitro на каждые четыре-шесть детенышей для инъекции. Быстро оттайте при 55 °C, пока не станет видно небольшое количество льда, и добавьте ячейки в подогретую среду CB (флакон должен быть еще холодным на ощупь). Используйте 1 мл среды для промывки каждого флакона и вращайте ячейки при 360 x g в течение 12 минут при 4 °C.
      Примечание: Было обнаружено, что быстрое размораживание при 55 °C приводит к лучшей жизнеспособности клеток (90%-95%), чем размораживание при 37 °C.
   3. Тщательно отсасывайте среду. Повторно суспендируйте (маленькую) гранулу в 2 мл CB-среды, аккуратно перемешайте и добавьте ~30 мкл клеточной суспензии в одну лунку в счетной пластине. Разведите 1:1 в трипановом синем, затем добавьте 10 μл в гемоцитометр и подсчитайте и усредните клетки из четырех квадрантов.
   4. Рассчитайте общее количество клеток CD34+, умножив количество клеток на 4 x 10⁴, а затем запишите жизнеспособность. Вращайте при 360 x g в течение 12 минут при 4 °C.
   5. Тщательно отсадите среду и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл стерильного PBS на n+1 детенышей для инъекции, в результате чего получится 250 000-450 000 CD34+ клеток на мышь. Поместите коническую трубку на лед в транспортировочный контейнер и отправляйтесь в виварий для инъекции щенка.
   6. Принесите в виварий BSC тепловую лампу, подгузники, шприц объемом 1 мл, иглу 18 г, иглу 30 г и клеточный препарат CD34+ в стерильных контейнерах. Поместите стерильный подгузник на ~2 фута под нагревательную лампу. Извлеките клетку с подстилкой, которую нужно впрыснуть, и поместите ее в BSC.
   7. Соберите шприц с помощью скошенной иглы массой 18 г. Совпадая угол конической трубки со скосом иглы, аккуратно перемешайте и подтяните клеточную суспензию. Положите щенков на пеленку, чтобы они согрелись (следите за перегревом). Удалите воздух из шприца и замените иглу 18 G на иглу 30 G, а затем осторожно надавите на шприц до тех пор, пока клеточная суспензия не окажется прямо на кончике игл><ы. заметка: В качестве альтернативы можно использовать инсулиновый шприц.
   8. Отводите по одному щенку к краю подгузника подальше от нагревательной лампы. Обездвижите щенка на боку под большим и указательным пальцами, чтобы обеспечить четкий обзор морды. Обратите внимание на вену поперек щеки под тем местом, где будет ухо. Введите иглу неглубоко в ближайшую к глазу вену (IV) и медленно введите 50 мкл клеток.
   9. Проверьте, не образуется ли пузырь от подкожной инъекции. Если это так, введите иглу глубже и приступайте к введению клеток. При успешном выполнении будет видна небольшая капля крови/гематома.
   10. Когда щенок все еще обездвижен, выполните внутрипеченочную инъекцию (ИГ) еще 50 мкл клеток (всего 100 мкл на каждого птенца IV+IH). Печень можно визуализировать как темное пятно между белой молочной полосой и грудной клеткой. Поместите щенка с инъекцией на пеленку подальше от неинъекционных щенков и согрейте.
       заметка: Внутривенная инъекция приводит к лучшему долгосрочному химеризму, чем только инъекция ИГ, но внутривенные инъекции не всегда успешны. Таким образом, разделение инъекции между внутривенным введением и внутривенным введением обеспечивает приживление большего процента мышей.
   11. Повторите инъекции в вены на лице и IH для всех щенков. Очистите от крови кровь, верните детенышей в гнездо в клетке и накройте подстилкой.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шприц 1 мл с иглами	Маккессон	1031815
Пробирки объемом 15 мл	Гренье Био-Уан	188271
2-меркаптоэтанол	сигма	М6250
Пробирки 50 мл	Гренье Био-Уан	227261
Сепаратор AutoMACS Pro	Милтеньи	Тел.: 130-092-545
БСА	Научный центр Фишера	BP1600100
Стойка Chill 15	Милтеньи	Тел.: 130-092-952
FCS эмбриональных стволовых клеток	Gibco	10439001
Пробирки Eppendorf; объем 1,5 мл	Гренье Био-Уан	616201
превосходить	Майкрософт
ФБС	репер	100-106 500 мл
Фиколл Гипак	GE Healthcare	45001752
стеклянные пипетки	DWK Медико-биологические науки	63А53
HBSS с Ca и Mg	сигма	55037К
МультиРад 350	Прецизионный рентгеновский аппарат
ПБС	Корнинг	45000-446
призма	Графпэд
Rec Hu FLT3L	Системы НИОКР	308-FK-005/CF
Рек Ху IL6	Системы НИОКР	206-ИЛ-010/КФ
Rec Hu SCF	Системы НИОКР	255СК010
Серологические пипетки 25 мл	Научный центр Фишера	1367811
Стерильный фильтр	Налген	567-0020
Стерильная молекулярная вода	сигма	7732-18-5
Анализатор клеток Yeti	Био-Рад	12004279