Адъювантная терапия на мышиной модели с не полностью резецированной подкожной опухолью

Аннотация

Источник: Rwandamuriye, F. X. et al., Мышиная модель неполностью резецированной саркомы мягких тканей для тестирования (нео)адъювантной терапии.J. Vis. Exp.(2020)

Это видео иллюстрирует тестирование адъювантной или дополнительной терапии на мышиной модели с не полностью резецированными подкожными опухолями. Частично резецированную опухоль мышь лечат антителом, нацеленным на антицитотоксический белок Т-регуляторных клеток, потенциально снижая повторный рост опухоли и предполагая эффективную адъювантную терапию.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Инокуляция клеток

1. Подготовка клеток и животных
   1. Следите за тем, чтобы клеточная линия поддерживалась в рекомендуемой среде. Например, поддерживайте клеточную линию WEHI 164 в среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 10% фетальной бычьей сыворотки, 20 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновой кислоты (HEPES), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
      заметка: Пропускать ячейки не менее 3 и до 5 раз после извлечения из криогенного хранилища. Чтобы обеспечить оптимальную жизнеспособность клеток, клетки следует разделять, когда они сливаются на 70-80%. Опухолевые клеточные линии должны быть проверены на микоплазму, так как инфекция может изменить рост клеток и повлиять на иммунный ответ in vivo.
   2. За сутки до прививки побрейте мышей на правом нижнем боку с помощью машинок для стрижки.
      заметка: В эксперименте использовались самки мышей BALB/c в возрасте от 8 до 12 недель с нормальным весом (16-22 грамма).
   3. В день инокуляции соберите WEHI 164 клетки, когда 70-80% слияются путем трипсинизации.
      1. Отсадите питательную среду из колб для тканевых культур, а затем добавьте стерильный фосфатный буферный раствор (1x PBS), чтобы удалить оставшиеся следы фетальной бычьей сыворотки (FBS).
      2. Аспирируйте PBS из колб с тканевыми культурами. Добавьте 3 мл 0,05% трипсина (для колбы T75) и затем переверните колбу так, чтобы вся поверхность колбы с клетками была покрыта трипсином.
      3. Инкубируйте колбу при 37 °C, 5%_CO2 инкубаторе в течение 3 мин. Периодически проверяйте ячейки, постукивая по стенкам колбы, чтобы убедиться, не сместились ли ячейки.
      4. Извлеките колбы из инкубатора для клеточных культур и добавьте 5 мл среды, дополненной FBS, для нейтрализации трипсина.
         заметка: Не оставляйте клетки в трипсине дольше, чем это необходимо, так как это может повредить клетки и привести к низкой жизнеспособности клеток.
      5. Пипетная суспензия несколько раз для получения одноклеточной суспензии. Перенесите суспензию ячейки в коническую центрифужную трубку.
      6. Пеллетные ячейки путем вращения при 350 x g в течение 3 мин.
   4. Промойте клетки три раза в 1x PBS.
      1. Ресуспендируйте клетки в 50 мл стерильного 1x PBS и промойте клетки пипетированием суспензии клеток вверх и вниз. Пеллетные ячейки путем вращения при 350 x g в течение 3 мин.
      2. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 15 мл стерильного 1x PBS. Промойте ячейки путем дозирования суспензии ячеек вверх и вниз. Пеллетные ячейки путем вращения при 350 x g в течение 3 мин.
      3. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки ровно в 10 мл стерильного 1x PBS. Промойте ячейки, как показано на шаге 1.1.4.2, и перенесите небольшое количество (примерно 100 мкл) клеточной суспензии в центрифужную пробирку для подсчета. Пеллетные ячейки путем вращения при 350 x g в течение 3 мин.
   5. Определите номер клетки с помощью метода исключения трипанового синего с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. Ресуспендируйте клетки в стерильном 1x PBS в концентрации 5 x 10⁶ клеток/мл. Держите клеточную суспензию на льду.
      заметка: Жизнеспособность опухолевых клеток должна быть равна или выше 80 % для обеспечения воспроизводимого опухолевого роста.
2. Подкожная инокуляция
   1. Тщательно перемешайте клеточную суспензию и наполните шприц с иглой 26 G 100 мкл клеточной суспензии (5 x^{10 5} клеток) в стерильном 1x PBS. Повторите перемешивание ячеек перед загрузкой следующего шприца.
      заметка: Держите клетки на льду на протяжении всей процедуры, чтобы сохранить жизнеспособность.
   2. Удерживайте мышь соответствующим образом, обеспечивая доступ к нижнему правому флангу. Сделайте мышь подкожной инокуляцией на выбритом правом нижнем боку.
      заметка: Убедитесь, что прививка не находится в брюшине, слегка приподняв иглу, которая должна быть видна под кожей. После инокуляции под кожей должна образоваться пузырчатая шишка.
   3. Наблюдайте за мышами в соответствии с требованиями действующего этического одобрения и выполняйте хирургическую резекцию, когда опухоли выросли до размера около 50^мм2.

2. Частичная хирургическая резекция опухоли

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол требует ДВУХ исследователей: один для хирургических процедур (ХИРУРГ), а другой для мониторинга мыши (АССИСТЕНТ).

1. Подготовка к операции
   1. На 12-й день после инокуляции, когда опухоли достигли размера примерно 50^мм2, за 30 минут до операции вводите мышам 100 мкл (0,1 мг/кг) бупренорфина с.к. в загривок шеи.
   2. Обустройте операционную зону с помощью грелки, накрытой слесарным халатом, и установите носовой конус для анестезии. Стерилизуйте хирургические инструменты перед использованием и между каждым животным с помощью термостерилизатора, дающего инструментам остыть перед использованием. Держите в чистоте и под рукой следующее хирургическое оборудование: хлоргексидин, тампон, марлю, глазной гель, два изогнутых щипца, ножницы, аппликатор клипс, средство для снятия клипс и сменные блоки для клипс (Рисунок 1A, 1B).
   3. Нагрейте нагревательную камеру до 37 °C и установите еще одну грелку для восстановления (рис. 1C). Поместите стерилизованные инструменты на стерильную поверхность, например, на автоклавные прокладки.
2. анестезия
   1. Поместите мышь в индукционную камеру и обезболите мышь 4% изофлураном (4% в 100% кислороде со скоростью потока 1 л/мин) до тех пор, пока частота дыхания не замедлится примерно до 60 вдохов в минуту (1 в секунду) (обычно это занимает <1 минуту><). заметка: Не оставляйте мышь в камере слишком долго, так как это может привести к удушью и смерти. Под анестезией должна находиться только одна мышь за один раз.
   2. Перенесите мышь на грелку на операционном столе, поместите мышь носом в носовой конус и поддерживайте состояние анестезии с помощью 3-4% изофлурана в 100% кислороде со скоростью потока 0,5 л/мин. Контролируйте частоту дыхания, чтобы убедиться, что глубина анестезии сохраняется. <бр/> заметка: АССИСТЕНТ должен следить за дыханием мыши на протяжении всей операции, чтобы обеспечить поддержание правильного уровня анестезии. Уменьшите концентрацию анестетика, если дыхание становится слишком медленным, или увеличьте концентрацию, если глубина анестезии слишком мала. Если мышь начинает задыхаться, удалите мышь из носового конуса, уменьшите концентрацию анестетика и подождите, пока дыхание не нормализуется, прежде чем снова положить его на носовой конус.
   3. Проведите «щипковый тест» и «тест роговицы», чтобы убедиться, что мышь полностью обезболена перед началом операции.
      заметка: Движение любой части мыши является признаком того, что мышь не полностью обезболилась. Животному следует немедленно дать дополнительное обезболивающее средство, увеличив концентрацию анестетика.
   4. Нанесите на глаза мыши небольшое количество офтальмологического геля, чтобы избежать сухости глаз.
3. Хирургическое вмешательство
   1. Проведите 3 раза тампон из хирургической области спиртовым хлоргексидином. С помощью щипцов и ножниц сделайте прямой разрез на 1 см вдоль тыльной стороны, на расстоянии 3 мм от опухоли (рис. 2А, 2В).
      заметка: Стандартизация разреза до 1 см у каждой мыши (с помощью линейки) позволяет равномерно оценить заживление ран между мышами. Расположение разреза на расстоянии 3 мм от опухоли позволяет проводить последующую внутриопухолевую адъювантную терапию без утечки из раны.
   2. С помощью пинцета оттяните лицевую поверхность и подкожную жировую клетчатку между опухолью и брюшиной. Подкожная опухоль в норме прикрепляется к стороне кожи.
   3. Откройте рану, осторожно удерживая кожу на несущей опухоль стороне с помощью пинцета, и «переверните» опухоль так, чтобы она была видна снаружи (рис. 2C, 2D).
      заметка: Участок опухоли, подлежащий удалению, должен быть ближе всего к отверстию, чтобы иметь достаточно кожи для закрытия раны. Будьте осторожны, чтобы не порезать кожу при удалении опухоли.
   4. С помощью ножниц разрежьте капсулу опухоли пополам, чтобы удалить ее, начиная от ближайшего к отверстию основания опухоли.
   5. Для операции по удалению объемных материалов на 50% разрежьте посередине опухоли. С помощью изогнутых щипцов зачерпнуть удаляемый участок опухоли (50%); Соберите остатки с отсыпанного участка.
   6. Для уменьшения объема на 75% выполните 50% удаление опухоли, как описано в части 2.3.5 выше. Затем разрежьте пополам оставшиеся 50% опухоли и зачерпните 25% опухоли с помощью изогнутых щипцов, как описано выше.
4. Закрытие места операции
   1. Поместите оставшуюся опухоль обратно под кожу и с помощью щипцов стяните кожные лоскуты вместе и выровняйте кожу вдоль раны.
   2. Удерживайте кожу вместе на расстоянии 5 мм от края раны и с помощью хирургических зажимов закройте рану, начиная с ближайшей к щипцам стороны. Наложите столько зажимов, сколько необходимо, чтобы не обнажить никакие подлежащие ткани. Как правило, наносятся три-четыре клипсы с зазором 2 мм между клипсами.<бр/> заметка: Если какие-либо зажимы плохо наложены, удалите их с помощью средства для удаления зажимов и замените их новыми зажимами.
5. Восстановление мышей
   1. Дайте мышам восстановиться, поместив их в теплую (37 °C) нагревательную камеру.
   2. Поместите клетку мыши на грелку. Наблюдайте за мышами в нагревательной камере до тех пор, пока они не оправятся от анестетика (не придут в себя и не будут ходить), а затем поместите мышей обратно в клетку. Оставьте клетку на грелке еще на 10 минут, пока мыши не станут более активными.
   3. Давайте мышам влажный и мягкий корм. Следите за мышами в течение 1 часа после операции для восстановления и следите за тем, чтобы зажимы оставались на месте. Убедитесь, что клетка наполовину надета на грелку, чтобы животные могли самостоятельно регулировать температуру, находясь без присмотра.
   4. Мышам дозируйте 0,1 мг/кг бупренорфина (100 мкл подкожно в область загривка) через 6-8 часов после операции (в конце дня). Наблюдайте за мышами рано утром следующего дня и снова вводите мышам 0,1 мг/кг бупренорфина (100 мкл подкожно в загривок). Давайте больше влажного корма по мере необходимости.
   5. Наблюдайте за мышами ежедневно в течение следующих семи дней. Клипсы можно снимать через семь дней с помощью устройства для удаления клипс.
6. Адъювантное или неоадъювантное лечение
   1. Проводите периоперационное лечение мышей с помощью (нео)адъювантной терапии в любой момент времени, в зависимости от интересующего лечения.
   2. Например, мышей вводили одну дозу 100 мкг анти-CTLA-4 внутрибрюшинно (в/в) на 15-й день после инокуляции или тремя дозами 200 мкг анти-PD-1 внутривенно на 15, 17 и 19 день после инокуляции.

Результаты

Рисунок 1: Репрезентативные изображения операционной установки.(A) Полное изображение операционной установки, показывающее хирургические инструменты (перечисленные в шаге 2.1) и анестезиологический аппарат. (B) Моментальное изображение хирургического стола, показывающее все материалы в пределах легкой досягаемости. (C) Нагревательная камера и грелка ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Инсулиновый шприц 26 калибра 0,5 мл	Бектон Дикинсон, Австралия	326769	никакой
2-Меркаптоэтанол	Лайф Текнолоджис Австралия Пти Лтд	21985023	никакой
Аппарат с обезболивающим газом	Darvall Vet, Австралия	Арт.No: 2848	никакой
Анти-CTLA-4	BioXcell, США	БЭ0164	никакой
Анти-PD-1	BioXcell, США	БП0273	никакой
Бупренорфина гидрохлорид для инъекций, 0,3 мг/мл	RB healthcare UK Limited, Великобритания	No 55175	Заказ по рецепту
Хирургический скраб с хлоргексидином 4%	Perigo Австралия, Австралия	CHL01449F(скраб	никакой
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота	CellSera, Австралия	AU-FBS-PG	никакой
Щипцы тонкие 10,5 см	Хирургический дом, Западная Австралия	CC74110	никакой
Щипцы тонкие 12 см зубчатые	Хирургический дом, Западная Австралия	CC74212	никакой
Щипцы Halsted 14 см	Хирургический дом, Западная Австралия	CD01114	никакой
камера подогрева	Datesand Ltd, Великобритания	Мини-термакаж	никакой
ГЕПЕС (1М)	Лайф Текнолоджис Австралия Пти Лтд	15630080	никакой
Изофлуран	Henry Schein Animal Health, Австралия	Арт.No: 29405	Заказ по рецепту
Смазывающая глазная мазь	Алкон	н/д	никакой
Пенициллин/стрептомицин 1000Х	Лайф Текнолоджис Австралия Пти Лтд	15140122	никакой
Фосфатный буферный раствор 10x	Лайф Текнолоджис Австралия Пти Лтд	70013-032	никакой
Зажимы Reflex 7 мм	Able scientific, Австралия	AS59038	никакой
Аппликатор с зажимом для раны Reflex 7 мм	Able scientific, Австралия	AS59036	никакой
Рефлекторное средство для удаления зажимов для ран	Able scientific, Австралия	AS59037	никакой
Дыхательный контур для анестезии грызунов Qube	Darvall Vet, Австралия	#7885	никакой
Мемориальный институт Розуэлл Парк (RPMI) 1640 Medium + L-глютамин	Лайф Текнолоджис Австралия Пти Лтд	21870092	никакой
Ножницы Iris STR 11 см	Хирургический дом, Западная Австралия	КФ3211	никакой
Ножницы Iris STR 9 см	Хирургический дом, Западная Австралия	ДЖН4209	никакой
Малая индукционная камера	Darvall Vet, Австралия	Арт.No: 9630	никакой
TrypLE express 1x	Лайф Текнолоджис Австралия Пти Лтд	12604-021	никакой