Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Обработка образца донорской кожи человека
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец человеческой кожи, использованный в этой трансплантации, был большим образцом, собранным из брюшной полости здорового пациента. Образец должен быть не менее 15 см х 7,5 см. Ограничения по размеру могут повлиять на количество мышей, для которых доступна кожа, и на выбор размера трансплантата.
- Перед препарированием и пересадкой образец кожи следует хранить при низких температурах (на льду; 4°C). Храните образец влажным в закрытом стаканчике для сбора образцов, смочив марлю в фосфатно-солевом буфере (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не рекомендуется хранить образец кожи при температуре 4 °C дольше 2 дней. Тем не менее, существуют отчеты, в которых образцы кожи хранятся в течение более длительного времени.
осторожность: Обрабатывайте все ткани человека с помощью стандартных мер биологической опасности.
- Подготовьтесь к дерматому-обработке образца кожи человека в стерилизованном капюшоне для культуры тканей с отрицательным давлением на стерилизованной доске для вскрытия.
- Поместите образец кожи эпидермисом вверх на доску для вскрытия. Протрите эпидермис стерильной спиртовой салфеткой, а затем PBS.
- Закрепите ближний край кожи на месте 1,5-дюймовым Т-образным штифтом (см. Таблицу материалов).
- Дерматомом нанесите образец кожи на толщину 400 мкм, оказывая постоянное давление, разрезая вперед под углом 30°-45°. Следуйте всем инструкциям по применению прибора и мерам безопасности (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о технике дерматомии, пожалуйста, ознакомьтесь с ранее опубликованным отчетом.
- Приготовьте чашку Петри размером 100 мм x 20 мм, положив на дно чашки стерильную марлю, смоченную в стерильном PBS. Поместите кожу эпидермисом вверх на влажную марлю.
- Закройте края пластины и накройте их полупрозрачной герметизирующей пленкой (см. Таблицу материалов), чтобы убедиться, что образец не загрязнен. Перед прививкой образец храните при температуре 4° C.
2. Предоперационная подготовка и подготовка
- Подготовьте стерильные инструменты и стерильную хирургическую станцию к пересадке. Используйте автоклавные бумажные полотенца в качестве стерильных поверхностей для размещения инструментов и мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей можно прививать после отъема, но предпочтительно их прививать в возрасте 8-10 недель. Мышей любого пола можно привить.
- Выполняйте хирургическую подготовку, такую как удаление волос, в зоне, физически отделенной от хирургической станции.
- Приготовьте анти-GR1 (см. Таблицу материалов), разбавив его до 1 мг/мл в стерильном физиологическом растворе. Дозируйте каждой мыши 100 мкг/100 мкл раствора анти-GR1 внутрибрюшинно после индукции анестезии.
- Обезболивайте мышей, по одной, изофлураном или другими институционально одобренными анестетиками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран необходимо давать в концентрации 3%-5% во время индукции. Как только мышь станет неподвижной, снизьте концентрацию изофлурана до 1-3%, чтобы повлиять на продолжительность операции.
- Следите за достаточной глубиной анестезии на мыши, наблюдая за частотой дыхания, отсутствием реакции на защемление пальцев ног и соответствующей розовой окраской ушей и рта.
осторожность: Используйте соответствующие анестезирующие аппараты и методы очистки, а также избегайте воздействия паров изофлурана.
- Перенесите мышь на грелку или другой источник тепла (см. Таблицу материалов).
- Введите офтальмологическую мазь, нанеся небольшую каплю мази на глаз пальцем в перчатке.
- Вводите анальгетики Бупренорфин (0,08 мг/кг) и Карпрофен (5 мг/кг) (см. Таблицу материалов) подкожно, защипывая кожу и вводя под углом, параллельным телу. <бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте анальгезию перед лечением в соответствии с протоколами учреждения. Следуйте рекомендациям учреждения по выбору и применению анальгетиков. Метод обезболивания, использованный в данном исследовании, описан в шаге 2.7 и на рисунке 1.
- Вводите анти-GR1 (приготовленный на шаге 2.4) внутрибрюшинно, слегка приподнимая мышь за хвост, обнажая брюшную полость, и вводя под углом 30° с помощью шприца с инсулином 1 мл (12,7 мм).
- Используйте безопасные для животных электрические машинки для стрижки (см. Таблицу материалов) для бритья средней и верхней частей спинной стороны мыши.
- Очистите все волосы и нанесите обильное количество мази для удаления волос на выбритую кожу на срок от 30 с до 1 минуты.
- Полностью протрите мазью для эпиляции бумажным полотенцем и ПБС.
3. Процедура трансплантации
- Переместите мышь во вторичное хирургическое место, подальше от станции удаления волос.
- Простерилизуйте место операции с помощью палочки с йодным тампоном круговыми движениями, начиная с середины и двигаясь к краю депилируемой области.
- Накройте мышь куском стерильной полиэтиленовой пленки и вырежьте в пластике окошко чуть большего размера, чем размер области, которую нужно привить.
- Отрежьте скальпелем участок донорской кожи прямоугольной формы размером 10 мм x 10 мм, подлежащий пересадке. Для этого крепко удерживая донорскую кожу на месте тыльной стороной щипцов и разрезая рядом с щипцами скальпелем.
- С помощью хирургических ножниц отрежьте прямоугольный участок кожи мыши, соответствующий размеру кусочка донорской кожи, создав ложе для трансплантата. Используйте щипцы, чтобы оттянуть кожу от тела, и разрежьте кожу ножницами, расположенными под углом к телу, чтобы избежать глубоких порезов в лице.
- Поместите кусочек донорской кожи эпидермисом вверх на подготовленное ложе для трансплантата.
- Используя заднюю часть щипцов, манипулируйте кожей, скользя вперед и назад, пока донорская кожа не ляжет полностью ровно на ложе трансплантата.
- Добавьте капли клея для хирургических тканей (см. Таблицу материалов) в месте соприкосновения донорской кожи с кожей мыши и удерживайте мышь и донорскую кожу щипцами в течение 1-2 с, чтобы клей прилип к тканям. Полностью запечатайте край прививки и дайте клею полностью высохнуть.
- Перевяжите мышей (рисунок 2), выполнив следующие действия.
- Отрежьте кусок вазелиновой марли (см. Таблицу материалов) достаточно большой, чтобы полностью покрыть область прививки.
- Накройте трансплантат вазелиновой марлей и слегка прижмите марлю к коже с помощью щипцов.
- Отрежьте полоску прозрачной пленочной повязки вдоль так, чтобы ширина была достаточно большой, чтобы покрыть рану мыши.
- Плотно прижмите прозрачную пленочную повязку клейкой стороной вниз к марле. Быстро покатайте мышь, чтобы полностью обернуть повязку вокруг туловища, убедившись, что она плотно прилегает, не затрудняя дыхание, а все конечности свободны для движений.
- Поместите мышь в клетку для восстановления и наблюдайте за ней, пока она не придет в состояние боевой готовности и не начнет двигаться. Обеспечьте источник тепла на части клетки не менее чем на 15 минут после восстановления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что животные выздоровеют в течение 1-5 минут после помещения их в клетку для восстановления.
