Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB. Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Создание модели на основе человеческого PBMC
- Миелоабляция мышей NOD/SCID с использованием циклофосфамида: определение оптимальных доз
- Купите самок мышей с диабетом и тяжелым комбинированным иммунодефицитом (NOD/SCID) без ожирения (6-8 недель).
заметка: Все мыши, участвовавшие в этом исследовании, были самками.
- Готовят циклофосфамид (ХП) в различных дозах (50, 100 и 150 мг/кг) в физрастворе. Приготовьте дисульфирам (ДС) в 0,8% Твин-80 в физиологическом растворе в концентрации 125 мг/кг.<бр/>
Примечание: Различные концентрации ЦП были приготовлены для того, чтобы обеспечить введение равных объемов раствора препарата мышам, получающим различные дозы ЦП.
- Обрабатывайте животных ХП (внутрибрюшинно, в/к) и ДС (перорально,.о.) один раз в сутки в течение 2 дней. Давайте DS (p.o.) через 2 ч после каждой дозы CP.
ПРИМЕЧАНИЕ: ДС снижает уротоксичность ЦП у мышей, а ЦП в сочетании с ДС, как предполагается, имеет более длительную нейтропению, чем животные, получавшие только ДЦП. Режим дозирования ХП, возможно, должен быть заранее определен до начала фактических исследований, и было обнаружено, что он незначительно варьируется между различными иммунодефицитными линиями мышей.
- Соберите образцы крови из орбитального венозного синуса и перенесите в покрытые окантовкой этилендиаминуксусной кислотой калия (ЭДТА-К) пробирки на лед в день 0 (за 1 ч до 1-й дозы), 2-й день (через 24 ч после2-й дозы) и 4-й день (через 72 ч после2-й дозы).
- Изучите эффект миелоабляции после лечения ХП и СД с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS). Используйте крысу антимышиный CD11b (M1/70), крысиный антимышиный Ly6C (HK1.4) и крысиный антимышиный Ly6G (1A8) для гейтированиявысокого уровня CD11b+Ly6C в качестве нейтрофилов, высокого уровня CD11b+Ly6C в качестве моноцитов.
- Записывайте массу тела и состояние здоровья мышей ежедневно в течение одной недели. Оптимальные дозы ХП и ДС определяются как режим, который приводит к максимальному истощению нейтрофилов и моноцитов без причинения тяжелой токсичности мышам.
- Трансплантация PBMC человека и приживление опухоли: модельная установка
- Выделите человеческие PBMC от здоровых доноров методом центрифугирования с градиентом плотности в соответствии с инструкциями производителя.
- Предварительно обработайте мышей ЦП и ДС, как указано на шагах 1.1.2 и 1.1.3 для повышения эффективности трансплантации.
- Через 20–24 ч после второй дозы ХП и ДС ввести опухолевую клеточную линию человека, такую как клетки А431 (ATCC, 2,5 x 106) и 5 x 106 выделенных PBMC (смешанных в общей сложности 200 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 50% Матригеля), или фрагменты опухоли (3 x 3 x 3мм3, в общем объеме 200 мкл PBS, содержащего 50% Matrigel) и 200 μл 5 x 106 PBMC (по 100 мкл слева и справа от приживленного фрагмента опухоли) подкожно (подкожно) в правый бок животных.
- Измеряйте объем первичной опухоли и регистрируйте два раза в неделю в течение 4-6 недель.
заметка: Мыши будут усыплены, как только их масса тела потеряет более 20% или объем опухоли достигнет 2000мм3 или опухоль будет изъязвлена.
- Усыпляйте мышей в газовых камерах углекислым газом. Соберите целые опухолевые ткани у умерщвленных мышей с помощью офтальмологических ножниц и обработайте их для гистологического и иммуногистохимического анализа (ИГХ). Исследуйте экспрессию CD8, PD-1 и PD-L1 человека в этих тканях.
