Основанное на миРНК ингибирование аутофагии в незрелых дендритных клетках, инфицированных вирусом простого герпеса

Аннотация

Источник: Düthorn, A., et al. Электропорация миРНК для модуляции аутофагии в моноцитарных дендритных клетках, инфицированных вирусом простого герпеса типа 1. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует технику вмешательства в аутофагический поток на основе небольшой интерферирующей РНК (миРНК). МиРНК, нацеленная на мРНК FIP200, вводится в моноцитарные незрелые дендритные клетки (iDCs) с помощью электропорации, вызывая подавление экспрессии FIP200 и приводя к ингибированию разрушения ядерного ламина посредством аутофагии. При добавлении вируса простого герпеса (ВПГ) выход ядра вирусного потомства ингибируется из-за отсутствия разрушения ламина через аутофагический поток.

Протокол

Моноцитарные ДК были получены из продуктов лейкафереза здоровых доноров. Для этого был получен положительный голос от местного комитета по этике (номер ссылки 4556). Эксперименты настоящего исследования проводились в соответствии с рекомендациями комитета по этике «Университета Фридриха-Александра Эрлангена-Нюрнберга» (номер ссылки 4556). Все доноры одобрили письменное информированное согласие, в том числе в соответствии с Хельсинкской декларацией.

1. Генерация и обработка незрелых дендритных клеток (iDCs) и зрелых дендритных клеток (mDCs)

1. Выделите мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC) из камер лейкорукционной системы (LRSC), как описано ранее. Избегайте криоконсервации PBMC и используйте их непосредственно после выделения для получения более высоких выходов DC.
2. Получение человеческих ДК из PBMC различных здоровых доноров в колбах с культурами клеток T175, как описано ранее. Вкратце, используйте 350-400 миллионов ПМК в 30 мл среды ДК (RPMI 1640 без L-глутамина, 1% (v/v) сыворотки крови человека типа AB (AB-сыворотка), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, 0,4 мМ L-глутамина, 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновой кислоты (HEPES)) в колбе для клеточной культуры для выделения моноцитов путем адгезивки. Через 1 ч смыть неадгезивную фракцию с помощью RPMI 1640. Добавьте свежую среду ДК с добавлением 800 Ед/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и 250 Ед/мл интерлейкина-4 (IL-4), и инкубируйте в течение 3 дней.
   1. На 3-й день после прилипания добавьте 5 мл свежей среды ДК, содержащей GM-CSF и IL-4 с конечной концентрацией 400 Ед/мл и 250 Ед/мл на колбу с клеточной культурой соответственно, для дифференцировки ДК.
   2. Чтобы собрать iDC, аккуратно промойте слабо адгезивные iDC со дна колбы для клеточных культур на 4-й день после адгезии. Повторите этот шаг 2 раза. Для получения мДК добавляют коктейль созревания, состоящий из следующих компонентов: GM-CSF (конечная концентрация: 40 Ед/мл), IL-4 (конечная концентрация: 250 Ед/мл), интерлейкин-6 (IL-6, конечная концентрация: 1000 Ед/мл), интерлейкин-1 бета (IL-1β, конечная концентрация: 200 Ед/мл), фактор некроза опухоли альфа (TNF-α, конечная концентрация: 10 нг/мл), простагландин E2 (PGE2; конечная концентрация: 1 мкг/мл).
   3. Через шесть дней после приверженности (через два дня после индукции созревания с помощью цитокинового коктейля) промойте mDC со дна колбы с клеточной культурой. Повторите этот шаг два раза.
      заметка: Незрелые и зрелые ДК могут быть последовательно получены от идентичных доноров в колбе с 1 клеточной культурой. Для этого (i) отделяют соответствующее количество iDC и (ii) индуцируют созревание оставшихся клеток в колбах с помощью цитокинового коктейля, перечисленного в шаге 1.2.2.
3. Перенесите iDC или mDCs в соответствующую среду для культивирования клеток в пробирки объемом 50 мл. Соберите клетки с помощью центрифугирования при 300 x g в течение 5 минут.
   1. Аккуратно ресуспендируйте (=промыть) ДК в 5-10 мл RPMI 1640 на колбу для клеточных культур. Соедините соответствующие суспензии постоянного тока в одну трубку.
   2. Определите номер ячейки с помощью счетной камеры или альтернативного метода. Избегайте изменения температуры при работе с iDC, чтобы снизить риск фенотипических изменений.

2. Проточный цитометрический анализ для мониторинга фенотипического статуса созревания

1. Перенесите iDC или mDCs (0,5 x 10⁶) с шага 1.3.1 в пробирку объемом 1,5 мл. Соберите клетки с помощью центрифугирования при 3390 x g в течение 1,5 мин. Один раз промойте клетки буфером FACS (PBS с добавлением 2% фетальной сыворотки теленка (FCS)).
2. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл окрашивающего раствора антител (буфер FACS), содержащего специфические антитела, меченные флуорохромом, против определенных поверхностных молекул.
   1. Используйте следующие антитела для проверки чистоты (CD3-флуоресцеин изотиоцианат [FITC], CD14-фикоэритрин [PE]), а также статуса созревания ДК (CD80-PacBlue [Pacific Blue]/-PE-цианин5 [Cy5], CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7).
   2. Приготовьте один неокрашенный образец в 100 мкл буфера FACS в качестве контроля.
   3. Покрасьте клетки на льду в темноте на 30 минут.
3. Затем промойте ячейки два раза в 1 мл буфера FACS и центрифугируйте при 3390 x g в течение 1,5 мин.
4. Наконец, ресуспендируйте клетки в 200 мкл буфера FACS с добавлением 2% параформальдегида (PFA) и проанализируйте клетки с помощью проточной цитометрии. Неподвижные элементы могут храниться при температуре 4°С в темное время суток до 2 суток.

3. Интерференция индуцированного ВПГ-1 аутофагического потока путем электропорации iDCs с использованием FIP200-siRNA

ПРИМЕЧАНИЕ: Настоящий протокол для электропорации миРНК был изменен из Prechtel et al. (2007) и Gerer et al. (2017).

1. Перенесите iDC (12 x 10⁶) на 3,5-й день после привержения в пробирку объемом 50 мл. Затем центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Параллельно проведите проточный цитометрический анализ для мониторинга состояния созревания, как описано в шаге 2 (используйте Life/Dead violet вместо CD80-PacBlue).
2. Аккуратно промойте iDC в 5 мл OptiMEM без фенолового красного и центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и аккуратно ресуспондируйте iDC в 200 мкл OptiMEM без фенолового красного, регулируя концентрацию клеток 6 x 10⁶/100 μл. Не ставьте клетки на лед и избегайте перепадов температуры. Двигайтесь дальше быстро и избегайте длительных инкубационных периодов iDC в OptiMEM без фенолового красного.
3. Перенесите либо 75 пмоль FIP200-специфичной миРНК, либо 75 пмоль скремблированной миРНК в качестве контроля в электрокюветы диаметром 4 мм и добавьте 100 мкл (6x10⁶ клеток) клеточной суспензии. Непосредственно импульсы iDC с помощью электропорационного аппарата I, применяя следующие настройки: 500 В в течение 1 мс.
   1. Перед проведением эксперимента приготовьте суспензии миРНК в соответствии с инструкцией производителя, аликвотируйте и храните их при температуре -20 °C. Разморозьте и держите их на льду при использовании этих миРНК для электропорации. Перед электропорацией образцов выполните тестовый импульс.
4. После электропорации непосредственно переносят iDC в 6-луночные планшеты со свежей предварительно подогретой средой DC (с добавлением 40 Ед/мл GM-CSF и 250 Ед/мл IL-4). Засейте клетки в конечной концентрации 1 x 10⁶/мл и поместите их в инкубатор. Не вымывайте элементы из электрокюветы.
5. Через 48 ч сначала изучите морфологию электропорированных iDC под микроскопом. Затем соберите клетки с помощью скребка клеток и перенесите их в пробирки объемом 15 мл. Промойте лунки 1 мл PBS с добавлением 0,01% этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и перелейте раствор в соответствующие пробирки.
6. Затем разделите 6 x 10⁶ iDCs для каждого условия миРНК, как описано в следующих шагах.
   1. Используйте 0,5 x 10⁶ клеток для оценки степени созревания и жизнеспособности клеток, как описано в шаге 2. Используйте следующие антитела: CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, MHCII-APC-Cy7 и Life/Dead violet.
   2. Используйте 1 x 10⁶ ячеек для вестерн-блоттинга, чтобы проверить эффективность нокдауна, специфичную для FIP200. Перенесите и соберите клетки в пробирку объемом 1,5 мл методом центрифугирования при 3390 x g в течение 1,5 мин. Получение лизатов клеток и проведение вестерн-блоттинга.
   3. Используйте оставшиеся клетки (4,5 x 10⁶) для экспериментов с инфекцией ВПГ-1. Для каждого экспериментального условия перенесите 2,25 x 10⁶ iDCs в пробирки объемом 2 мл и либо инфицируйте их HSV1 при кратности инфекции (MOI) 2, либо добавьте буфер MNT в качестве имитационного контроля. Выполните заражение, как описано.
   4. Через 20 ч после инфицирования (hpi) соберите клетки с помощью скребка для клеток и подготовьте клеточные лизаты для вестерн-блоттинга.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
4D-нуклеофекторный блок ядра (аппарат электропорации II)	Lonza (Базель, Швейцария)	ААФ-1002Б
AB-сыворотка	Sigma Aldrich Chemie GmbH (Штайнхайм, Германия)	Н4522	Культивирование дендритных клеток
АКД-А	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Штайнхайм, Германия)	9007281
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (электропорационный комплект аппарат II)	Lonza (Базель, Швейцария)	В4ХП-3024
Реагент для обнаружения блоттинга Amersham ECL Prime Western	GE Healthcare (Золинген, Германия)	RPN2232	Обнаружение вестерн-блоттинга
Персульфат аммония (АФС)	Sigma Aldrich Chemie GmbH (Штайнхайм, Германия)	А3678
anti-mouse-IgG (мышиные, поликлональные, HRP)	Cell Signaling (Лейден, Нидерланды)	7076	Обнаружение вестерн-блоттинга
anti-rabbit-IgG (козьи, поликлональные, HRP)	Cell Signaling (Лейден, Нидерланды)	7074	Обнаружение вестерн-блоттинга
BD FACS Canto II Проточный цитометр	BD Biosciences (Гейдельберг, Германия)	338962
Блоттинговая камера Fastblot B44	Biometra (Гёттинген, Германия)	846-015-100
CCR7 (мышь, Pe-Cy7)	BioLegend (Фелл, Германия)	557648	Проточная цитометрия Разбавление: 1:100 Клон: G043H7
CD11c (мышь, Pe-Cy5)	BD Biosciences (Гейдельберг, Германия)	561692	Проточная цитометрия Разбавление: 1:100 Клон: B-ly6
CD14 (мышь, ПЭ)	BD Biosciences (Гейдельберг, Германия)	555398	Проточная цитометрия Разбавление: 1:100 Клон: M5E2
CD3 (мышь, FITC)	BD Biosciences (Гейдельберг, Германия)	555332	Проточная цитометрия Разбавление: 1:100 Клон: UCHT1
CD80 (мышь, V450)	BD Biosciences (Гейдельберг, Германия)	560442	Проточная цитометрия Разбавление: 1:100 Клон: L307.4
CD83 (мышь, БТР)	eBioscience Thermo Fisher Scientific (Лангензельбольд, Германия)	Тел.: 17-0839-41	Проточная цитометрия Разбавление: 1:200 Клон: HB15e
CD86 (мышь, PE)	BD Biosciences (Гейдельберг, Германия)	553692	Проточная цитометрия Разбавление: 1:100
Визуализация клеток EVOS FL	Система AMG/Life Technologies (Карлсбад, США)	AMF4300
FIP200 (кролик)	Cell Signaling (Лейден, Нидерланды)	No 12436	Обнаружение вестерн-блота Разбавление: 1:1000 Клон: D10D11
Аппарат Gene Pulser II (аппарат электропорации I)	BioRad Laboratories GmbH (Мюнхен, Германия)	165-2112
GM-CSF (4x104 Ед/мл)	Miltenyi Biotec (Бергиш-Гладбах, Германия)	Тел.: 130-093-868
HLA-DR (мышь, APC-Cy7)	BioLegend (Фелл, Германия)	307618	Проточная цитометрия Разбавление: 1:200 Клон: L243
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43	Биовекс		Инфекция ДК
ИЛ-1β (0,1x106 Ед/мл)	Cell Genix GmbH (Фрайбург, Германия)	1411-050
Ил-4 (1x106 Ед/мл)	Miltenyi Biotec (Бергиш-Гладбах, Германия)	Тел.: 130-093-924
Ил-6 (1x106 Ед/мл)	Cell Genix GmbH (Фрайбург, Германия)	1404-050
Принтер ImageQuant LAS 4000	GE Healthcare (Золинген, Германия)	28955810
L-глютамин	Lonza (Базель, Швейцария)	17-605Э
LIVE/DEAD Исправимый набор для окрашивания фиолетовых мертвых клеток	Life Technologies (Карлсбад, Калифорния, США)	Л34964	L/D окрашивание в проточной цитометрии
Лимфопреп	Alere Technologies AS (Осло, Норвегия)	04-03-9391/01
Хлорид магния	Carl Roth GmbH (Карлсруэ, Германия)	А537.1
Мегафуге 2.0 RS	Heraeus (Ханау, Германия)	75015505
Счетная камера Нойбауэра	Бренд (Вертхайм, Германия)	717805
Nunc Колбы для клеточных культур (175,0 см2)	Thermo Scientific (Рокфорд, США)	159910 (Английский
Параформальдегид, 16 %	Alfa Aesar, Хейверхилл, США	43368.9М
PerfectSpin 24 Плюс	Peqlab (Эрланген, Германия)	С2500-Р-ПЛ
PGE2 (1 мг/мл)	Pfizer (Берлин, Германия)	BE130681
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Lonza (Базель, Швейцария)	17-512Ф
RestoreTM Буфер для снятия вестерн-блоттинга	Thermo Scientific, Рокфорд, США	No 21059
Платформа-качалка wt 15	Biometra (Гёттинген, Германия)	042-590 (Английский)
РотиБлок	Carl Roth GmbH (Карлсруэ, Германия)	А151.4
Roti-Load 1 (4 шт.)	Carl Roth GmbH (Карлсруэ, Германия)	К929.3
Ротифорезе гель 30 (37,5:1)	Carl Roth GmbH (Карлсруэ, Германия)	3029.1
РПМИ 1640	Lonza (Базель, Швейцария)	12-167Ф
Додецилсульфат натрия (SDS)	Carl Roth GmbH (Карлсруэ, Германия)	2326.2
Комфорт термомиксера	Eppendorf (Гамбург, Германия)	5355 000.011
TNF-α (10 мкг/мл)	Peprotech (Гамбург, Германия)	300-01А
Трис	Carl Roth GmbH (Карлсруэ, Германия)	4855.3
Раствор трипана синего (0,4 %)	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Штайнхайм, Германия)	Т8154
Подросток 20	Carl Roth GmbH (Карлсруэ, Германия)	9127.1
Ватман 0,2 мкм нитроцеллюлозная мембрана	GE Healthcare (Золинген, Германия)	10600001
Бумага для хроматографии WhatmanTM 3 мм Chr	Fisher Scientific GmbH (Шверте, Германия)	3030917

) См. Кабель