Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Животные
- Выращивание самок мышей C57BL6/J до 8-недельного возраста в индивидуально вентилируемых клетках с микроизоляционными фильтрами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Женщинам отдается предпочтение потому, что анатомическое строение их наружного мочеполового аппарата делает катетеризацию более легкой, чем у мужчин.
2. Клеточная культура
- Поддерживайте клеточную линию уротелиальной карциномы мыши MB49 в среде RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной при нагревании фетальной сыворотки крупного рогатого скота и 50 мкг/мл гентамицина при 37 °C в увлажненном 5% углекислом газе (CO2).
- Выращивайте клетки MB49 в колбах Т-75 до 80% конфлюенции. Трипсинизируют и ресуспендируют в дозе 0,5 × 105 - 0,5 × 106 клеток на 150 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) перед имплантацией мышам.
3. Внутрипузырный имплантат
опухоли
- Обезболивайте мышей смесью анестетиков золетил и ксилор (33 мг/кг и 20 мг/кг соответственно), вводимых внутрибрюшинно.
- Поместите животных в лежачее положение и зафиксируйте задние лапы к подушечке скотчем. Лапы должны быть достаточно разобщены, чтобы уретральный проход был хорошо виден и легко доступен для введения катетера.
- ПРИМЕЧАНИЕ: Для катетеризации детский венозный катетер 24 G подходит для мышей в возрасте от 8 до 10 недель. Выбор катетера имеет решающее значение для предотвращения утечки жидкости между стенкой уретры и катетером. Катетеры большего диаметра должны использоваться для более крупных или старых мышей.
- С помощью небольшого кусачки зажмите один край наружной части мочеиспускательного канала и очень аккуратно поверните его в сторону «головного конца» мышей. Это действие обнажает уретральный проход.
- Извлеките внутреннюю иглу катетера и введите последнюю в уретру под углом 45°, слегка ориентировав в сторону «хвостового конца» мышей. Не применяйте силу при введении катетера; В случае сопротивления просто очень аккуратно поверните катетер, пока он не проскользнет внутрь мочеиспускательного канала. Когда около 0,5-0,8 см катетера окажется в уретре, осторожно поместите катетер параллельно хвосту мышей и введите его полностью.
- С помощью шприца объемом 1 мл, иглу которого необходимо ввести в катетер, промыть мочевой пузырь от остатков мочи путем введения 200-300 мкл стерильного PBS и аспирировать всю жидкость из мочевого пузыря.
- ПРИМЕЧАНИЕ: При введении PBS мочевой пузырь наполнится, и между задними лапами мышей будет виден отек, что подтверждает правильность катетеризации. Большинство катетеров имеют мертвый объем, который необходимо учитывать при расчете объема инъекции.
- С помощью стерильного шприца объемом 1 мл введите 200 мкл 0,1 Н соляной кислоты (HCl). Наполните мочевой пузырь так, чтобы сжечь всю его стенку. Через 10 сек удалить всю кислоту и немедленно нейтрализовать, введя 200 мкл 0,1 Н гидроксида натрия (NaOH) с помощью стерильного шприца. В случае введения наибольшего числа клеток (0,5 × 106) стадия подкисления не требуется.
- Отсадите всю остаточную жидкость и немедленно промойте полость 300 мкл стерильного PBS.
- Опорожните мочевой пузырь путем аспирации и введите в мочевой пузырь 150 μл PBS, содержащего клетки MB49 (диапазон 0,5 × 105 - 0,5 × 106). Оставьте шприц в собранном виде на катетере, чтобы избежать утечки клеток. Шприц лучше закрепить, зафиксировав его к прокладке скотчем.
- Через 1 час осторожно извлеките катетер из мочеиспускательного канала и поместите мышей в клетку под лампой накаливания, пока они не проснутся: обычно это происходит между 1 и 2 часами после окончания лечения.
4. Внутрипузырная доставка белка, активирующего нейтрофилы Helicobacter pylori (HP-NAP)
- ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере, через 3 дня после инстилляции клеток можно начинать лечение.
- Катетеризируйте в соответствии с шагами с 3.1 по 3.4. На этом этапе не стоит обжигать стенку мочевого пузыря HCl.
- С помощью шприца объемом 1 мл промыть мочевой пузырь от остатков мочи путем введения 200-300 мкл стерильного PBS и аспирировать всю жидкость из мочевого пузыря.
- Введите в мочевой пузырь 50 мкг HP-NAP на 150 мкл PBS. Оставьте шприц прикрепленным к катетеру, чтобы избежать утечки белкового раствора. Закрепите шприц, зафиксировав его на прокладке скотчем.
- Через 1 час аккуратно извлеките катетер из уретры и поместите мышей в клетку под лампу накаливания до тех пор, пока они не проснутся.
