$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были проверены local
институциональный комитет по уходу за животными и ветеринарный наблюдательный совет JoVE. Все процедуры по сбору проб были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Генерация вирусных Ag-специфичных CD8+ Т-клеток из iPSCs (iPSC-CD8+ T-клеток)
- Создание ретровирусных конструкций
заметка: Гены α и β Т-клеточного рецептора (TCR) связаны с последовательностью саморасщепления 2A. Ретровирусным вектором MSCV-IRES-DsRed (MiDR) является DsRed+.
- Субклонирование специфичных к HBs183-191 (FLLTRILTI) A2-ограниченных генов гибрида человека и мыши (s183 TCR) (Vα34 и Vβ28) в MiDR для создания конструкции s183 MiDR (рис. 1A).
- Ретровирусная трансдукция
Клетки Platinum-E (Plat-E) используются для упаковки ретровирусов (несущих гены s183 TCR), которые будут использоваться для ретровирусной трансдукции. Клетки Plat-E являются эффективными ретровирусными упаковочными клетками, лежащими в основе 293T-клеток, которые были разработаны с помощью уникальных упаковочных конструкций с помощью промотора EF1α для экспрессии белка ретровирусной структуры, включая gag, pol и экотропную среду.
- На 100 мм культуральной чашке высевать 3 x 106 Plat-E клеток в 8 мл питательной среды DMEM, содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка (FCS), в инкубаторе при 37 °C с 5%CO2, за 1 сутки до трансфекции.
- На 0-й день трансфектируйте конструкцию s183 MiDR в клетки Plat-E с помощью реагента для трансфекции ДНК.
- В день 1 посейте 1 x 106 иПСК (зеленый флуоресцентный белок [GFP]+) в культуральную пластину, предварительно покрытую желатином.
- На 2–3-е сутки соберите из культуры клеток Plat-E содержащий ретровирусы надосадочную жидкость для трансдуцирования иПСК с помощью s183 TCR в присутствии раствора 1,6-дибромгексана.
- На 4-й день трипсинизируйте иПСК, трансдуцированные геном s183 TCR, центрифугируйте при 400 x g в течение 5 мин и засейте 3 × 105 иПСК в 100 мм чашку для культивирования, предварительно покрытую 3 x 106 облученными питающими клетками SNL76/7 (irSNL76/7).
- На 5 или 6 день слияния трипсинизируйте клетки, центрифугируйте при 400 x g в течение 5 минут и обработайте для сортировки клеток. Стробирование на живых клетках сортируют двойные положительные клетки GFP и DsRED (iPSCs, трансдуцируемые геном s183 TCR) с помощью высокоскоростного сортировщика клеток. Аналогично шагу 1.2.5, совместное культивирование отсортированных клеток на фидерных клетках irSNL76/7 для будущего использования.
- Дифференцировка HBV-специфичных iPSC-CD8+ Т-клеток
Примечание: Стромальные клетки OP9-DL1/DL4 сверхэкспрессируют оба лиганда Notch DL1 и DL4, и совместное культивирование iPSCs с iPSCs может способствовать дифференцировке Т-клеток, опосредованной сигнализацией Notch.
- Выращивайте иПСК, трансдуцированные геном s183 TCR (s183/iPSCs) в монослое клеток OP9-DL1-DL4 в среде α минимально необходимой (MEM), содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Включите в культуру мышиный лиганд FMS-подобной тирозинкиназы 3 (Flt3) (mFlt-3L; конечная концентрация = 5 нг/мл).
- В день 0 высевают 0,5–1,0 x 105 S183/iPSCs в 10-сантиметровую культуральную чашку, предварительно выращенную клетками OP9-DL1-DL4. Убедитесь, что клетки OP9-DL1-DL4 находятся в состоянии 80–90% конфлюенции.
- На 5-й день промойте ИПСК 10 мл фосфатно-солевого буферного раствора (ПБС), отсадите ПБС, добавьте к 4 мл 0,25% трипсина и инкубируйте в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 10 мин. После этого добавьте еще 8 мл среды для иПСК для прекращения расщепления трипсина. Накопите все пищеварительные растворы, содержащие клетки, и центрифугируйте при 400 x g в течение 5 минут при температуре 15–30 °C.
- Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 10 мл среды iPSC. Перенесите клеточную суспензию на новую 10-сантиметровую чашку Петри и инкубируйте в инкубаторе в течение 30 мин при 37 °С.
- Через 30 минут соберите среду iPSC, содержащую плавающие клетки. Пропустите клеточную суспензию через сетчатое фильтр 70 μм и рассчитайте количество клеток.
- Засейте 5 x 105 клеток в чашку для культивирования предварительно выращенных клеток OP9-DL1-DL4 с состоянием 80%–90% конфлюентности, как описано на шаге 1.3.1.
заметка: Для дифференцировки Т-клеток каждые 2–3 дня клетки, полученные из iPSC, необходимо повторно засеять свежим слоем клеток OP9-DL1-DL4.
- оценка
- Морфологические изменения дифференцировочных иПСК
- Наблюдайте за клетками под микроскопом в разные дни.
заметка: К 5-му дню колонии имеют мезодермоподобные характеристики, демонстрируя классическую веретенообразную морфологию, напоминающую человеческие дермальные фибробласты, и устойчивый рост in vitro. К 8 дню начинают появляться небольшие круглые скопления клеток.
- Анализ дифференцировки иПСК методом проточной цитометрии
- В различные дни совместного культивирования анализируйте клетки, полученные из iPSC, как описано ранее (рис. 1B, C).
- Функциональный анализ дифференцировочных ИПСК
- На 28-й день совместного культивирования соберите iPSC-CD8+ Т-клетки из культур путем забора плавающих клеток, трипсинизируйте оставшиеся клетки 0,25% трипсина, повторно суспендируйте в 8 мл среды iPSC, центрифугируйте в течение 5 мин при 400 x g при 15–30 °C, удалите среду, затем повторно суспендируйте клетки в 10 мл среды.
- Повторно суспензированные клетки выдержите в свежей 10-сантиметровой посуде в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 30 минут и соберите плавающие клетки. Затем промойте клетки один раз холодной PBS.
- Инкубировать 3 x 106 Тл-истощенных спленоцитов (CD4-CD8-) селезенки H-2-класса I, HLA-A2.1-трансгенных (HHD) мышей с 5 мкМ пептидом s183 (FLLTRILTI) в 200 мкл среды при 4 °C в течение 30 мин.
- Получить смесь iPSC-CD8+ Т-клеток со спленоцитами, пульсирующими пептидом s183 (Т-клетки: спленоциты = 1:4; используйте 0,75 x 106 Т-клеток). Инкубировать смесь клеток при температуре 37 °C в инкубаторе сСО2 в течение 40 ч. В течение последних 7 ч добавьте 4 мкл разведенного брефелдина А в культуру (конечная концентрация 1000x, которая будет разбавлена в 1x питательной среде) для блокирования транспортных процессов во время активации клеток.
- Окрашивание клеток и проведение проточного цитометрического анализа внутриклеточного интерферона-гамма (ИФН-γ), как описано ранее (рис. 2).
2. Индукция репликации HBV через гидродинамическую доставку плазмиды HBV
ПРИМЕЧАНИЕ: конструкция pAAV/HBV1.2 была сгенерирована, как описано ранее. Полная ДНК HBV 1.2 включена в вектор pAAV.
- Гидродинамическая доставка плазмиды HBV через хвостовую вену
- Нагревайте мышей HHD с помощью тепловой лампы в течение 5 минут в клетке, чтобы расширить хвостовую вену.
- Задержите животное с помощью удерживающего устройства, а мышиные хвосты очистите спреем с 70% этанолом.
- Доставка плазмиды в печень.
- Измерьте массу тела мыши с помощью измерительных весов.
- Разведите 10 г плазмиды HBV в 8% эквиваленте массы тела PBS (например, 1,6 мл для мыши массой 20 г). Загрузите разведенную плазмиду в шприц объемом 3 мл иглой для подкожных инъекций массой 26 г × 1⁄2 дюйма (0,45 × 12 мм).
- Найдите одну из двух боковых хвостовых вен в средней трети хвоста и поместите иглу в любую боковую вену. Введите инъекцию, содержащую плазмиду HBV, через хвостовую вену в течение 3 - 5 с.
- Количественная оценка виремии из сыворотки крови инфицированных мышей
заметка: Репликация HBV происходит с 3 по 35 день в сыворотке мыши. Репликация ДНК достигает пика на 7-й день и постепенно снижается. ДНК HBV не выводится из сыворотки крови до 35-го дня.
- Сбор сыворотки крови инфицированных мышей
- Соберите примерно 0,1 мл крови в микроцентрифужную пробирку от каждой мыши через 3, 5, 7 и 10 дней после заражения ретроорбитальным кровотечением в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, затем инкубируйте при комнатной температуре (ОТ) в течение 20 минут.
- Центрифугируйте образец при 6 000 x g в течение 15 минут при 4 °C и соберите надосадочную жидкость сыворотки после центрифугирования.
- Очистите ДНК из сыворотки крови с помощью имеющегося в продаже набора для экстракции ДНК в соответствии с рекомендациями производителя. Вкратце, лизуйте клетки в колонке на основе диоксида кремния, выполните промывку и извлеките ДНК путем добавления 100% этанола в колонну элюирования и центрифугирования при 6000 x g в течение 1 минуты. Элюируйте ДНК в 50 мкл воды, не содержащей РНКазы.
- Используйте 100 нг ДНК HBV из элюирования для ПЦР-анализа в реальном времени. Используйте следующие праймеры и щупы: вперед 5' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3'; реверс 5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3'; зонд 5' TCACCTCTGCCTAATC 3'.
- Используйте геном HBV, содержащий плазмиду (pAAV/HBV1.2) для стандартной кривой и выполните ПЦР в реальном времени в общем объеме 10 мкл (рис. 3).
- Настройте реакцию ПЦР в общем объеме 10 μл, как показано в таблице 1.
- Настройте программу ПЦР в термоамплификаторе, как показано в таблице 2. Запрограммированная скорость температурного перехода составляет 20 °C/s для денатурации/отжига и 5 °C/с для растяжения. Измеряйте флуоресценцию в конце фазы отжига для каждого цикла для мониторинга ПЦР в режиме реального времени.
3. Снижение репликации HBV путем ACT вирусных Ag-специфичных iPSC-CD8+ Т-клеток
- Адоптивный перенос клеток (ACT)
- Дифференцировать s183/iPSCs (1.3.7) по стромальным клеткам OP9-DL1-DL4 в присутствии mFlt-3L и mIL-7 в течение 8 дней, как описано в разделе 1.3.
- На 22-й день соберите iPSC-CD8+ Т-клетки из 10-сантиметровой пластины с трипсином, затем промойте и повторно суспендируйте каждую 10-сантиметровую пластину в 10 мл свежей среды. Добавьте ячейки в свежую 10-сантиметровую тарелку и верните в инкубатор на 30 мин, как это сделано в разделе 1.3. Через 30 мин соберите плавающие ячейки.
- Используйте нейлоновое ситечко длиной 70 мкм для пропускания клеток, чтобы удалить клеточные кластеры и подсчитать количество клеток. Отрегулируйте клетки до концентрации 1,5 x 107 клеток/мл в холодном растворе PBS и используйте нейлоновое фильтр 70 мкм для пропуска клеток, чтобы при необходимости снова устранить клеточные кластеры. Держите клетки на льду до проведения АКТ.
- Введите 200 мкл клеточной суспензии (3 x 106 клеток) 4–6-недельным мышам с HHD через хвостовую вену.
- Индукция репликации HBV
- На 14-й день после переноса клеток проведите гидродинамическую доставку плазмиды HBV через хвостовую вену, как описано в разделе 2.1.
Таблица 1: Объем ПЦР-реакции
| Шаблон ДНК | 2 мл |
| Смесь мастер-гибридизации ДНК (Taq ДНК-полимераза, буфер для ПЦР-реакции, 10 мМ MgCl2 и смесь dNTP) | 1 мл |
| 25 мМ MgCl2 | 0,8 мл |
| 0,3 мкМ пробник | 3 мл |
| 5 мкМ каждого праймера | 3,2 мл |
| итог | 10 мл |
Таблица 2: Программа ПЦР
| денатурация | Температура
95 °C | Время
5 с |
| отжиг | 53 °C | 10 с |
| расширение | 72 °C | 20 с |
| 5 °C | |
