Клеточная терапия аутоиммунного артрита на мышиной модели

Аннотация

Источник: Haque, M. et al., Разработка антиген-специфических регуляторных Т-клеток, полученных из стволовых клеток, против аутоиммунитета.J. Vis. Exp. (2016)

Это видео демонстрирует клеточную терапию аутоиммунного артрита у мышей. Регуляторные клетки, полученные из iPSC, экспрессирующие рецепторы, специфичные для овальбумина, вводят метилированный бычий сывороточный альбумин (mBSA), эмульгированный в адъюванте. Мышиные антигенпрезентирующие клетки (APC) обрабатывают и представляют mBSA Т-клеткам, вызывая активацию Т-клеток и миграцию к синовиальной мембране коленного сустава. Последующие инъекции включают только mBSA в левом колене и комбинацию mBSA и овальбумина в правом колене. В левом колене иммунный ответ на mBSA вызывает артрит, в то время как в правом колене Т-регуляторные клетки, взаимодействуя с овальбумином, смягчают воспаление, улучшая симптомы артрита.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Созревание in vivo и подавление аутоиммунного артрита

1. Создание конструкций для использования в ретровирусной трансдукции путем субклонирования генов рецептора Т-клеток OT-II (TCR) и белка 3 вилочной головки (FoxP3) в плазмиду MiDR, связанную с саморасщепляющимся пептидом 2А, для создания конструкции MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3.
2. Выполнение ретровирусной трансдукции индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с использованием клеток Plat E в качестве упаковочной клеточной линии.
3. Дифференцировка in vivo и индукция артрита у мышей.
   1. Дифференцировать OT-II TCR/FoxP3-трансдуцированные iPSCs (OT-II-FoxP3/iPSCs), FoxP3-трансдуцированные iPSCs и DsRed трансдуцированные iPSCs на стромальных клетках OP9-DL1-DL4-I-A^b в присутствии цитокинов mFlt-3L и mIL-7 в течение 8 дней.
   2. В 0-й день посев^{B-клеток} OP9-DL1-DL4-I-A с минимальной плотностью 10⁴ клеток/^см2 с использованием среды OP-9 (α-MEM среды, содержащей 20% эмбриональной сыворотки телят (FCS) и 2,2 г/л бикарбоната натрия. Тарелка 1 х 10^{по 6} ячеек на 10 см блюдо.
   3. На 3-й день, когда^{b-клетки} OP9-DL1-DL4-I-A становятся на 80-90% сливающимися, удалите среду и затравите 0,5 - 1 x 10⁵ iPSCs над B-клетками OP9-DL1-DL4--I-A в среде OP-9><. ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет обеспечить совместное культивирование iPSCs на b-клетках OP9-DL1-DL4-I-A и считается днем 0 дифференцировки.
   4. На 5-й день удалите среду из 10-сантиметровой чашки с помощью аспирации, промойте клетки 10 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS) и аспирируйте PBS. Добавьте 4 мл 0,25% трипсина и выдерживайте при 37 °C в течение 10 минут. Добавьте еще 8 мл среды iPSC в клетки, повторно суспендируйте их и центрифугируйте при 400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
      1. Аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 10 мл iPSC среды. Инкубируйте эти повторно суспензированные клетки на свежей 10-сантиметровой посуде и верните в инкубатор на 30 мин.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите фидерные клетки OP9-DL1-DL4-I-A^b и сохраните дифференцирующие иПСК в среде. Постоянно поддерживайте^{b-клетки} OP9-DL1-DL4-I-A для достижения 80-90% конфлюенции для дальнейшего совместного культивирования.
      2. Через 30 минут соберите плавающие клетки, отфильтруйте их через сетчатое фильтр 70 μм и подсчитайте с помощью гемоцитометра.
   5. Засейте 5 x 10⁵ иПСК в свежий 80 - 90% конфлюент OP9-DL1-DL4-I-A^b клеток в среде OP9. Дополните среду mFlt-3L в конечной концентрации 5 нг/мл.
   6. Трипсинизируйте все три вида клеток из 10-сантиметровой пластины и повторно суспензируйте клетки с каждой 10-сантиметровой пластины в 10 мл свежей среды. Добавьте ячейки в свежую 10-сантиметровую пластину и верните в инкубатор на 30 мин. Через 30 мин соберите плавающие ячейки.
   7. Пропустите клетки через клеточный фильтр 70 мкм, чтобы удалить клеточные кластеры и подсчитать с помощью гемоцитометра. Отрегулируйте ячейки до концентрации 1,5 x 10⁷ клеток/мл в холодном PBS и при необходимости снова отфильтруйте. Держите клетки на льду до тех пор, пока адоптивные клетки не перейдут к мышам.
   8. Введите 200 мкл клеточной суспензии (3 x 10⁶ клеток) в три разные группы 4-6-недельных самок мышей C57BL/6 через хвостовую вену.
   9. На 10-й день, после переноса клеток, с помощью шприца объемом 1 мл мышам вводили 100 мкг метилированного бычьего сывороточного альбумина (мБСА), эмульгированного в полном адъюванте Фройнда у основания хвоста.
   10. На 17 день обезболите мышей с помощью испарителя изофлурана. Используйте 4 - 5% изофлуран для индукции и 1 - 2% для поддержания. Вызвать артрит путем внутрисуставного введения 20 г mBSA в 10 μl PBS в левый коленный сустав и 20 μг mBSA и 100 μг цельного овальбумина (OVA) в 10 μl PBS в правый коленный сустав. После развития артрита на подстилку можно положить еду и гелевый пакет. Мышей усыпляют: оценка упитанности тела (BCS) 2/5 или умирающая, сильная кахексия и/или постоянное лежачее положение (24-часовой период) и оценка тяжести 4. Оценка тяжести 4. Оценка 4 балла эритема и сильный отек охватывают лодыжку, стопа и пальцы, или анкилозы конечности.
4. Характеристика OT-II TCR/FoxP3-трансдуцированных ИПСК
   1. Используйте флуоресцентный микроскоп (20X) для визуализации незафиксированных живых клеток DsRed⁺ GFP⁺.
   2. Изучите интеграцию и экспрессию генов с помощью вестерн-блоттинга и проточной цитометрии.
5. Анализ на подавление артрита
   1. Измерьте отек обоих колен мышей перед индукцией артрита, используя штангенциркуль с циферблатом, чтобы установить исходный уровень.
   2. Следуйте инструкциям (1.3.1 - 1.3.10) для индукции артрита и переноса Treg. Измерьте колени мыши с помощью штангенциркуля после переноса Treg.
   3. Рассчитайте процентное увеличение диаметра колена: Процентное увеличение = (Диаметр колена в день 1 - Диаметр колена в день 0) / Диаметр колена в день 0.
6. Измерение разрушения суставов и инфильтрации воспалительных клеток в коленях методом гистологии (Рисунок 1).
   1. На 7-й день после индукции артрита усыпьте мышей путем ингаляции углекислым газом (CO₂) с последующим вывихом шейки матки. Удалите волосы с коленей с помощью электрической машинки для стрижки и иссеките колени хирургическим путем.
   2. Снимите кожу с ног, сделав надрез на задней ноге тупыми ножницами, и разрежьте кожу поперек бедра и вниз до лодыжки. Аккуратно отклейте кожу над ногой и ступней, чтобы обнажить мышцу. Удалите мышцу с ноги аккуратно, не повреждая коленный сустав.
      1. Разрежьте заднюю ногу чуть выше тазового/тазобедренного сустава и отрежьте большеберцовую кость острыми ножницами для препарирования.
   3. Зафиксируйте колени в 4% формалине на 48 ч. Декальцинируйте колени с помощью 2,5 М муравьиной кислоты; трижды промойте в ксилоле в течение 3 мин, дважды промойте в 100% этаноле, дважды промойте в 95% этаноле, дважды промойте в деионизированной воде в течение 2 мин и удалите кальцинацию в 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА). Обрабатывать при температуре ниже кипения (90 °C) в течение 20 минут.
   4. Удалите оба колена, зафиксируйте в 10% формалине, а в Formical-4 проведите кальцификацию. Погрузите ткани в парафин, срез 4 мкм, и окрашивайте гематоксилином и эозином (H & E) или окрашиванием Safranin O и наблюдайте под микроскопом.

Результаты

Рисунок 1: Адоптивный перенос Ag-специфичных iPSC-Tregs улучшает AIA у мышей. Мышиные иПСК трансдуцировали с помощью ретровирусной конструкции MiDR, MiDR-FoxP3 или MiDR-TCR-FoxP3 и совместно культивировали^на b-клетках OP9-DL1/DL4/I-A. На 7-й день ген-трансдуцированные клетки (3 × 10⁶ на мышь) были адоптивно перенесены самкам мышей C57BL/6, индуцированным AIA, че...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
мыши C57BL/6j	Лаборатория Джексона	664
α-MEM	Инвитроген	А10490-01
ФБС	Гиклон	Ш3007.01
Полибрен	сигма	107689
Генератор помех	Интегрированная наука	No 204130
mFlt-3L	Пепротех	250-31л
мИл-7	Пепротех	217-17
mBSA	сигма	А7906
Яйцевидный альбумин	Авангард	0440-01
CFA	Дифко	2017014
Удерживатель хвостовых жил	Научный брейнтри	РТВ 150-СТД
Параформальдегид	сигма	П6148-500Г	Внимание: Аллергенный, канцерогенный, Токсичный

шт.