Метод ex vivo для получения опухолеспецифичных химерных антигенных рецепторов Т-клеток

Аннотация

Источник: Riccione, K., et al. Генерация CAR-Т-клеток для адоптивной терапии в контексте стандарта лечения глиобластомы. J. Vis. Exp. (2015).

Это видео демонстрирует технику генерации ex vivo Т-клеток химерного антигенного рецептора (CAR) опухолевого антигена. Ретровирусные векторы, несущие трансгенную РНК, смешивают с клетками селезенки в среде с добавлением интерлейкина-2 для содействия выживанию и пролиферации Т-клеток. Затем смесь переносят на пластину, покрытую рекомбинантными фрагментами фибронектина человека, и центрифугируют, чтобы облегчить слияние вируса с клеткой, что позволяет РНК интегрироваться в геном хозяина и производить поверхностно связанные CAR, нацеленные на опухолевый антиген.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Спленэктомия и препарирование Т-клеток

День 0:

1. Налейте 10 мл Т-клеточной среды (ТКМ) в коническую форму объемом 50 мл и положите на лед для сбора селезенки.
2. Принесите в жертву соответствующее количество животных путем удушения_СО2 и вторичного обезглавливания: Поместите животных в клетку, получающую_СО2 со скоростью потока 10-30% объема клетки в минуту, в соответствии с рекомендациями Американской ветеринарной медицинской ассоциации (не более 5 животных могут быть принесены в жертву одновременно) до прекращения дыхания и в течение двух минут после этого. Извлеките животных из камеры CO₂ и обезглавите.
   заметка: Из одной селезенки самки мыши C57BL/6 в возрасте 6–12 недель образуется примерно 4,5–5 x 10⁷ спленоцитов. Здесь будет собрано 4 селезенки примерно для 200 x 10⁶ клеток.
3. Положите мышь так, чтобы ее правая сторона была обращена вверх, и сбрызните 70% этанолом. С помощью щипцов захватите тонкую складку кожи ниже левой грудной клетки и сделайте небольшой надрез ножницами. Снимите кожу, аккуратно захватите щипцами тонкую складку брюшины, и разрежьте небольшую полость.
4. Селезенка представляет собой небольшой, вытянутый, темно-красный орган, напоминающий сплющенный боб; осторожно захватите селезенку щипцами и исчерпайте, отрезав окружающую соединительную ткань. Поместите иссеченную селезенку в конику, содержащую 10 мл ТКМ, на лед.
5. Налейте селезенку на сетчатое сетчатое сетчатое ситечко размером 70 мкм и разложите путем разминания тупым концом внутренней части шприца объемом 5 мл до получения одноклеточной суспензии. Максимум две селезенки должны быть дезагрегированы на одно сетчатое ситечко.
6. Используйте небольшой объем ТКМ, чтобы тщательно промыть ситечко после дезагрегации, чтобы собрать оставшиеся спленоциты. Объедините все дезагрегированные слои селезенки в одноклеточную суспензию. Доведите окончательный объем до 50 мл с помощью TCM за одно мытье и отжимайте при 300 x g в течение 10 минут.
7. Приготовьте раствор 1x лизисного буфера, добавив 5 мл 10-кратного лизисного буфера в 45 мл стерильной воды. Чтобы устранить эритроциты, ресуспендируйте гранулы в 5 мл 1x лизисисного буфера на селезенку в конической форме объемом 50 мл, хорошо перемешивая, осторожно пипетируя вверх и вниз. Если количество селезенки превышает 5, используйте центрифужную пробирку объемом 250 мл. Поместите коническую или центрифужную трубку в водяную баню при температуре 37 °C на 5 минут.
8. Удалите реакцию лизиса с водяной бани и добавьте ТКМ в соотношении 1:1 с буфером для лизиса для нейтрализации реакции. Стирать отжимом при 300 х г в течение 10 минут.
9. Аспират надосадочная жидкость и полностью ресуспендированная гранула в ТКМ (2 мл/селезенка, всего 8 мл на 4 селезенки) путем пипетирования вверх и вниз.
10. Подсчитайте клетки, добавив 10 мкл клеточной суспензии к 190 мкл трипанового синего (разведение 1:20). Умножьте число, полученное в одном из четырех квадратов с сеткой, на 20 x 10⁴ x общий объем (8 мл), чтобы получить общее количество клеток (например, 125 клеток x 20 x 10⁴ x 8 мл = 200 x 10⁶ спленоцитов).
11. Развести клетки до концентрации 2 х^{10 6} клеток/мл в ТКМ, добавив 2 мкг/мл конканавалина А (КонА) и 50 МЕ/мл рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (рИЛ-2). Таким образом, для 200 x 10⁶ спленоцитов добавьте 92 мл среды к 8 мл клеток, 200 мкг ConA и 5000 МЕ rhIL-2.
12. Добавьте 2 мл клеток в каждую лунку 24-луночных планшетов, обработанных тканевой культурой, таким образом, чтобы в каждой лунке находилось 4 x^10-6 клеток (например, для 100 мл клеток потребуется примерно 4 планшета).
13. Инкубировать в течение ночи при 37 °C с 5%_CO2.

2. Трансдукция

День 1:

1. Рассчитайте количество обработанных 24-луночных планшетов, не подвергшихся тканевому культивированию, необходимое для трансдукции, умножив количество собранных селезенок на 2 (для 4 селезенок необходимо 8 планшетов).
2. Далее рассчитайте необходимый объем раствора рекомбинантного фрагмента фибронектина человека (RHFF), необходимого для покрытия планшетов, путем умножения (общее количество лунок + 3) х 0,5 мл (8 планшетов х 24 лунки = 192 + 3 = 195) х 0,5 мл = 97,5 мл.
3. Приготовьте 97,5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего RHFF, в концентрации 25 мкг/мл путем умножения общего объема на 25 мкг (97,5 х 25 = 2437,5 мкг). Добавьте это количество RHFF к 97,5 мл PBS.
4. Оболочка без культуры тканей обрабатывала 24-луночными планшетами путем добавления 0,5 мл раствора PBS/RHFF на лунку.
5. Выдерживать в течение ночи при температуре 4 °C.

День 2:

6. Сбросьте раствор PBS/RHFF из 24-луночных планшетов, не обработанных тканевыми культурами.
7. Добавьте 1 мл/лунку 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.
8. Удалите БСА, плотно перевернув пластину. Умыться, добавив 2 мл PBS.
9. Соберите вирусную надосадочную жидкость путем переноса среды из каждой эмбриональной почки человека, покрытой 293T (HEK293T)-поли-D-лизином (PDL), в центрифужную пробирку объемом 250 мл и вращайте в течение 10 минут при 500 x g.
10. Осторожно переложите вирусный надосадочный жидкость в свежую центрифужную пробирку объемом 250 мл, следя за тем, чтобы не потревожить клеточную гранулу, которая могла образоваться.
11. Добавьте свежую ТКМ в вирусную надосадочную жидкость таким образом, чтобы конечный объем был на 3 мл больше, чем количество, необходимое для лунок, покрытых RHFF. Например, для 192 лунок, покрытых RHFF, доведите объем вирусной надосадочной жидкости до 192 + 3 мл = 195 мл.
12. Извлеките культивированные спленоциты из инкубатора и повторно суспендируйте путем аккуратного пипетирования вверх и вниз 2 - 3 раза в каждую лунку. Переложите в коническую форму объемом 250 мл. При использовании многоканальной пипетки использование стерильного резервуара перед переносом поможет ускорить этот этап. Считайте, как описано выше, и вращайте при 300 x g в течение 10 минут.
13. Добавить рекомбинантный человеческий интерлейкин-2 (rhIL-2) к вирусной надосадочной жидкости в концентрации 50 МЕ/мл. Например, добавьте 50 x 195 = 9,750 МЕ rhIL-2 к 195 мл вирусной надосадочной жидкости.
14. Ресуспендирование спленоцитов в вирусной надосадочной жидкости в дозе 1 x 10⁶ клеток/мл
15. Добавьте 1 мл/лунку суспензии спленоцитов в 24-луночные планшеты, покрытые RHFF.
16. Вращение в течение 90 минут в соответствии со следующими настройками: 770 x g, ускорение = 4, тормоз/замедление = 0, 32 °C.
17. Приготовьте раствор ТКМ с концентрацией 50 МЕ/мл rhIL-2. Например, приготовьте раствор 200 ТКМ, добавив 10 000 МЕ рхИЛ-2. Добавьте по 1 мл rhIL-2/TCM в каждую лунку после центрифугирования.
18. Культивировать в течение ночи при 37 °C с 5% CO₂.

3. Культивирование и сбор CAR-Т-клеток

Дни 3 и 4:

1. Если Т-клетки достигают >80% конфлюенции, клетки могут быть разделены (обычно это происходит на 3-й или 4-й день). Чтобы разделить клетки, осторожно проводите пипетку вверх и вниз в каждую лунку 2-3 раза и перемещайте по 1 мл из каждой лунки в новые лунки свежей 24-луночной чашки, обработанной культурой тканей. Затем добавьте 1 мл свежей ТКМ с 50 МЕ/мл IL-2 в каждую лунку так, чтобы конечный объем составил 2 мл во всех лунках.
2. Если клетки не достигают >80% конфлюенции, выполните половинную замену среды, медленно отпиливая 1 мл среды с верхней части каждой лунки. Избегайте нарушения клеток, осевших на дне, во время удаления среды. Добавьте 1 мл свежей ТКМ, содержащей 50 МЕ/мл rhIL-2.

День 5:

3. Ресуспендируйте CAR-Т-клетки путем осторожного пипетирования вверх и вниз 3 раза в каждой лунке и переложите в центрифужную пробирку объемом 250 мл. Вращайте ячейки при 300 x g в течение 10 минут.
4. Полностью асасировать надосадочную жидкость без мешающих гранул. Промойте один раз с помощью PBS, посчитайте ячейки, как описано выше, и промойте с помощью PBS второй раз. Типичный выход CAR-Т-клеток составляет примерно 1 x 10⁶ клеток на лунку (8 планшетов x 24 лунки = 192 x 10⁶ CAR-Т-клеток).
5. Ресуспендировать клетки в PBS в концентрации 5 x 10⁷/мл для инъекции 1 x 10⁷ в объеме 200 мкг (например, для 192 x 10⁶ CAR-T-клеток ресуспендировать промытую гранулу в 3,84 мл PBS).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Конканавалин А	Сигма Олдрич	С2010	Неспецифический митоген для индуцирования пролиферации Т-клеток и вирусной трансдукции
РПМИ 1640	Технологии Life	11875-093	Среды для культивирования Т-клеток
Бычий сывороточный альбумин (БСА), фракция V — стандартная норма	Продукты Gemini Bio	700-100Р	Блокирует неспецифическое связывание ретровируса с пластинами, покрытыми ретронектином
Фарм Лиз (10X концентрат)	BD Biosciences	555899	Лизирует эритроциты во время процессинга спленоцитов
70 μм Стерильные клеточные фильтры	Корнинг	No 352350 (Английский	Отфильтровывает крупные частицы тканей во время обработки спленоцитов
100 мм чашки для культур BioCoat с поли-D-лизином	Корнинг	356469	Способствует адгезии клеток HEK293 для максимизации пролиферации после трансфекции
Диметилсульфоксид	Сигма Медико-биологические науки	Д2650	Необходим для полного растворения темозоломида
соляной	Хоспира	ИМ 0132 (5/04)	Растворитель для темозоломида и кетамина/ксилазина
Кетатезия гидрохлоридная	Генри Шейн Здоровье животных	11695-0701-1 (Английский	Раствор кетамина
АнаСед	Ллойд Инк	Н/Д	Ксилазин стерильный раствор 100 мг/мл

) )