Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB. Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Неспецифическое расширение цитотоксических эффекторных Т-лимфоцитов
- Подготавливают и облучают питающие ячейки при 35 Гр. Для стимуляции 2 x 105 - 4 x 105 эффекторных клеток подготовьте 10 x 106 мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) и 1 x 106 B-лимфобластоидных клеточных линий (BLCL) от трех разных здоровых доноров.
- Ресуспендируйте как фидерные, так и эффекторные клетки в 15 мл среды Мемориального института Розуэлл Парк (RPMI) с добавлением 10% инактивированной при нагревании эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 2 мМ L-глутамина, пенициллина (100 МЕ/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл) и 300 МЕ/мл рекомбинантного интерлейкина-2 (ИЛ-2).
- Добавьте фитогемагглютинин (PHA-L) в конечной концентрации 1 мкг/мл, тщательно перемешайте и распределите 150 мкл клеточной суспензии на лунку в 96-луночных U-образных планшетах.
- Инкубировать при температуре 37 °C и 5%CO2 во влажной атмосфере.
- Ежедневно проверяйте планшет до тех пор, пока в культуральных лунках не образуются большие клеточные комки (~день 7).
- Переложите клетки в колбу для культур в концентрации 1 x 106 клеток/мл в свежей питательной среде.
- Определите общее количество клеток путем подсчета (2 раза в неделю) и поддерживайте их на уровне 1 x 106 клеток/мл в свежей питательной среде.
заметка: Эффекторные иммунные клетки должны быть готовы к терапевтическому введению в состоянии покоя (обычно через 3 недели после первоначального амплификационного стимула). Чистота и реактивность этих эффекторных клеток должны быть проверены перед инъекциями in vivo (например, с помощью анализов in vitro).
2. Предоперационная подготовка эффекторных клеток
- После проверки количества эффекторных клеток соберите эффекторные клетки в пробирку объемом 50 мл методом центрифугирования (300 x g в течение 5 мин).
заметка: Чтобы компенсировать любые потери, приготовьте избыток клеток (например, 50 x 106).
- Осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 15 мл стерильного PBS и центрифугируйте в течение 5 минут при 300 x g для выполнения промывки.
- Осторожно и полностью удалите надосадочную жидкость, а затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл стерильного PBS.
- Перенесите ресуспендированные клетки в микропробирку объемом 1,5 мл для центрифугирования при давлении 300 x g в течение 5 минут.
- Осторожно и полностью удалите надосадочную жидкость путем медленного пипетирования.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 8 мкл стерильного PBS на мышь.
заметка: Это критически важный шаг.
- Измерьте объем клеточной суспензии с помощью микропипетки. При необходимости добавьте стерильный PBS (20 x 106 клеток в 15 мкл PBS на дозу) и тщательно перемешайте.
- С помощью микропипетки убедитесь, что конечный объем на одну мышь составляет от 15 до 20 мкл (обязательно < 20 мкл).
- Держите клетки на льду до стереотаксической инъекции.
заметка: Более 3-х часовых временных точек не тестировались.
3. Стереотаксическая инъекция
- Настройка оборудования
- Соберите и откалибруйте стереотаксическую рамку для мелких животных в соответствии с инструкциями производителя, чтобы обеспечить точность внутричерепных инъекций (например, размер шприца, желаемый объем и скорость инъекции).
заметка: Рекомендуется медленная скорость инфузии (т.е. 2 - 3 мкл/мин).
- Установите материал под шкафом микробиологической безопасности (MSC) для поддержания стерильности инструментов и защиты мышей от инфекций.
заметка: Поместите «изотермические блоки» на водяную баню при температуре 37 °C. Эта система ограничивает гипотермию мышей во время операции. Грелки, которые необходимы для постпроцедурного ухода, должны использоваться во время непрерывного контроля температуры.
- Предоперационная подготовка животных
- Обезболивайте мышь с помощью внутрибрюшинной инъекции кетамина (10 мг/мл) и ксилазина (0,1 мг/мл) в дозе 10 мкл/г массы тела мыши.
- Проведите тест на защемление пальца ноги, чтобы убедиться в полной анестезии и обезболивании животного.
заметка: Любое движение является признаком неглубокой анальгезии, и если это происходит, требуется еще несколько минут, прежде чем повторить операцию.
- После того, как мышь будет должным образом обезболивая, с помощью ножниц удалите шерсть с места операции (между двумя ушами, вплоть до носа).
- Предоперационная подготовка клеток
- Осторожно ресуспендируйте клетки с помощью пипетки (несколько раз) перед каждой инъекцией, чтобы предотвратить слипание клеток.
- Осторожно наберите необходимый объем клеточной суспензии (15 - 20 мкл) в микрошприц 22-G, чтобы избежать аспирации пузырьков.
заметка: Этот этап загрузки клеток в микрошприц важен для минимизации отклонений в вводимых объемах. Перезагружайте клетки для каждой отдельной инъекции между процедурами, чтобы предотвратить слипание клеток и обеспечить четное количество вводов эффекторных клеток в когорте.
- Затем поместите шприц в адаптированный шприцевой насос.
- Процедурный уход
- Продезинфицируйте место операции тампонами, смоченными в растворе повидон-йода 5% не менее 3 раз.
- Поместите смазывающую офтальмологическую мазь в глаза мыши, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
- Поместите мышь под наркозом на стереотаксическую рамку, на теплый изотермический блок, накрытый стерильной полиэтиленовой пленкой, чтобы поддерживать температуру мыши во время операции и ограничить смертность><.
заметка: Нос и зубы мыши должны быть соответствующим образом расположены над зубным стержнем, чтобы обеспечить адекватный дыхательный поток во время процедуры.
- Как только мышь будет расположена над зубчатым стержнем, плотно затяните ушные планки под ушами мыши, чтобы обездвижить голову.
заметка: Будьте осторожны, чтобы не повредить барабанные перепонки и не нарушить дыхание.
- Сделайте сагиттальный разрез кожи по средней линии стерильными ножницами вдоль верхней части черепа спереди назад, чтобы обнажить череп.
- Определите пересечение сагиттального и коронального швов (Bregma), которые послужат ориентирами для стереотаксической локализации до инъекции (показано на рисунке 1).
- Поместите микрошприц выше этой точки.
- Переместите микрошприц на 2 мм вправо и на 0,5 мм вперед от Bregma.
- С помощью микросверла стерильным сверлом проделайте небольшое отверстие в черепе по заранее заданным координатам. Будьте осторожны, оставайтесь поверхностными, чтобы избежать травматического повреждения мозга.
заметка: В этом протоколе иммунные клетки вводились внутрь установленной опухоли (через неделю после инъекции опухолевых клеток). Кожа должна быть вновь открыта (рубец) и инъекция выполняется в тех же координатах, которые использовались для имплантации опухолевых клеток (отверстие обычно все еще присутствует до 2 недель после инъекции). Были подобраны координаты для введения опухолевых и эффекторных клеток в паренхиму мозга.
- Инъекция иммунных эффекторных клеток
- Осторожно введите микрошприц в просверленное отверстие и, медленно двигаясь, вперед иглу на 3 мм вниз в твердую мозговую оболочку, а затем назад на 0,5 мм на конечную глубину 2,5 мм перед введением эффекторных клеток.
- Запустите инъекцию эффекторных клеток со скоростью 2 - 3 мкл/мин и контролируйте мышей на протяжении всего времени инъекции.
- После завершения инъекции извлеките иглу всего на 1 мм и удерживайте микрошприц на месте еще одну минуту, прежде чем медленно полностью извлечь микрошприц, чтобы предотвратить утечку из места инфузии.
заметка: Вслед за извлечением животного из стереотаксического аппарата немедленно очистите инъекционный аппарат для предстоящих экспериментов.
- Послеоперационный уход и последующее наблюдение за мышью
- Снимите животное со стереотаксической рамки и немедленно нанесите на место разреза 5% раствор повидон-йода и закройте кожу соответствующим хирургическим швом.
- Нанесите 2% гель с лидокаином непосредственно на рану и введите 0,15 мкг/г бупренорфина путем подкожной инъекции для постпроцедурной анальгезии.
- Поместите мышь под наркозом обратно в клетку над грелкой, установленной на 37 °C, чтобы поддерживать соответствующую температуру тела мыши и избежать переохлаждения.
заметка: Отдельное жилье не нужно.
- Наблюдайте за мышью до тех пор, пока она полностью не оправится от анестезии, и перенесите ее в жилую комнату><.
заметка: На сегодняшний день этот протокол хорошо поддерживается, так как произошло несколько непредвиденных осложнений (< 5% инъекционных мышей).
- Ежедневно наблюдайте за мышами и усыпляйте их, когда наблюдаются какие-либо признаки ухудшения здоровья (например, сгорбленная осанка, снижение подвижности, прострация или значительная потеря массы тела [≥ 15%]).
