Генетическая модификация CAR-Т-клеток с помощью системы CRISPR-Cas9

Аннотация

Источник: Sterner, R. M. et al., Использование CRISPR/Cas9 для выбивания GM-CSF в CAR-T-клетках.J. Vis. Exp. (2019)

В видео описывается процесс создания генетически модифицированных CAR-T-клеток с помощью системы CRISPR-Cas9. Инфицирование Т-клеток лентивирусами CRISPR и CAR приводит к модификации гена-мишени и синтезу химерного антигенного рецептора или CAR, что в конечном итоге приводит к образованию генетически модифицированных CAR-T-клеток.

Протокол

1. Производство ячеек CART19

1. Выделение, стимуляция и культивирование Т-клеток ex-vivo
   1. Проводите все работы с клеточными культурами в капюшоне для клеточных культур с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты. Соберите мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) из обезличенных нормальных конусов донорской крови, собранных во время афереза, поскольку они, как известно, являются жизнеспособным источником PBMC.
   2. Чтобы выделить PBMC, добавьте 15 мл среды с градиентом плотности в разделительную пробирку с градиентом плотности 50 мл. Разбавьте донорскую кровь равным объемом фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS), чтобы избежать захвата клеток.
      1. Добавьте разбавленную донорскую кровь из конуса в разделительную пробирку, стараясь не нарушить границу раздела между кровью и средой градиента плотности. Центрифугируйте при 1 200 x g в течение 10 мин при RT.
      2. Надосадочную жидкость сцедить в новую коническую жидкость объемом 50 мл, промыть PBS + 2% FBS, доведя до 40 мл, центрифугировать при 300 х г в течение 8 мин при РТ, асасировать надосадочную жидкость, повторно суспендировать в 40 мл буфера и подсчитать клетки.
   3. Выделите Т-клетки из PBMC с помощью набора магнитных шариков с отрицательным отбором с использованием полностью автоматизированного сепаратора клеток в соответствии с протоколом производителя.
   4. Для культивирования выделенных Т-клеток готовят Т-клеточную среду (ТКМ), состоящую из 10% АБ-сыворотки человека (v/v), 1% пенициллин-стрептомицина-глутамина (v/v) и бессывороточной гемопоэтической клеточной среды. Стерилизуйте среду путем фильтрации через стерильный вакуумный фильтр 0,45 мкм, а затем с помощью стерильного вакуум-фильтра 0,22 мкм.
   5. В день 0 (день стимуляции Т-клеток) промойте гранулы CD3/CD28 перед стимуляцией Т-клеток. Для мытья поместите необходимый объем бусин (используйте достаточное количество гранул CD3/CD28 в соотношении 3:1 бусины:Т-клетки; обратите внимание, концентрация гранул может варьироваться) в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и ресуспендировать в 1 мл ТКМ.
   6. Поместите в контакт с магнитом.
   7. Через 1 мин аспирируйте ТКМ и повторно суспендируйте в 1 мл свежей ТКМ для промывки шариков.
   8. Повторите эту процедуру в общей сложности три стирки.
   9. После третьей стирки снова суспензируйте бусины в 1 мл ТКМ.
   10. Посчитайте Т-клетки.
   11. Перенесите шарики в Т-клетки в соотношении 3:1 бусины:клетки.
   12. Разбавьте клетки до конечной концентрации 1 x 10⁶ клеток/мл.
   13. Инкубировать при 37 °C, 5%_CO2 в течение 24 часов.
2. Трансфекция и трансдукция Т-клеток
   1. Проводите лентивирусную работу с использованием мер предосторожности BSL-2+, включая использование капюшонов для клеточных культур, средства индивидуальной защиты и дезинфекцию используемых материалов отбеливателем перед утилизацией.
   2. Приобретение конструкции химерного антигенного рецептора-T19 (CART19) в лентивирусном векторе.
      заметка: Используемая здесь конструкция CART19 была разработана, а затем синтезирована de novo с использованием коммерчески доступного поставщика синтеза белка. Конструкция CAR впоследствии была клонирована в лентивирус третьего поколения под контролем промотора EF-1α. Фрагмент вариабельной области с одной цепью получен из клона FMC63 и распознает CD19 человека. Конструкция CAR19 обладает костимулирующим доменом 4-1BB второго поколения и стимуляцией CD3ζ (FMC63-41BBz).
   3. Осуществляйте выработку лентивирусов так, как описано ранее.
      1. Вкратце, для производства лентивируса используют 293T-клетки, достигшие 70-90% конфлюенции.
      2. Перед добавлением в 293T-клетки в течение 30 мин при комнатной температуре проводят инкубацию реагентов для трансфекции, включающих 15 мкг представляющей интерес лентивирусной плазмиды, 18 мкг вектора упаковки gag/pol/tat/rev, 7 мкг вектора оболочки VSV-G, 111 мкл реагента для предварительного комплексообразования, 129 мкл реагента для трансфекции и 9,0 мл среды для трансфекции. Затем культивируют трансфицированные клетки при 37 °C, 5%_CO2.
      3. Сбор, центрифуга (900 x g в течение 10 мин), фильтр (нейлоновый фильтр 0,45 μM) и концентрат надосадочной жидкости через 24 и 48 ч путем ультрацентрифугирования при концентрифугировании при 13 028 x g в течение 18 ч или 112 700 x g в течение 2 ч.
      4. Заморозьте при -80 °C для дальнейшего использования.
   4. В 1-й день осторожно ресуспендируйте Т-клетки, чтобы разрушить розетки Т-клеток, которые стимулировались в дозе 1 x 10⁶/мл в 0-й день.
   5. При соблюдении соответствующих мер предосторожности BSL-2+ для всех лентивирусных работ, добавляйте свежий или замороженный собранный вирус к стимулированным Т-клеткам при кратности инфекции (MOI) 3,0.
3. Экспансия CAR Т-клеток
   1. Во время фазы экспансии продолжайте инкубацию трансдуцированных Т-клеток при 37 °С, 5%_СО2. Подсчитайте количество CAR-Т-клеток на 3-й и 5-й день и добавьте в культуру свежую, предварительно подогретую ТКМП для поддержания концентрации CAR-Т-клеток на уровне 1 x 10⁶/мл.
   2. Удалите шарики из трансдуцированных Т-клеток через 6 дней после стимуляции (6-й день) с помощью магнита. Соберите, восстановите и поместите Т-клетки в конические пробирки объемом 50 мл в магните на 1 минуту. Затем соберите надосадочную жидкость (содержит CAR-Т-клетки) и выбросьте шарики.
   3. Поместите собранные CAR-Т-клетки обратно в культуру в концентрации 1 x 10-6 клеток/мл для возобновления экспансии.
   4. На 6-й день оцените поверхностную экспрессию CAR с помощью проточной цитометрии.
      заметка: Для определения поверхностной экспрессии CAR можно использовать несколько методов, таких как окрашивание козьим антимышиным антителом IgG (H+L) с перекрестной адсорбцией или окрашивание специфическим пептидом CD19, конъюгированным с флуорохромом. Здесь возьмите аликвоту (около 100 000 Т-клеток) из культуры и промойте проточным буфером, приготовленным из фосфатно-солевого буфера Дульбекко, 2% фетальной бычьей сыворотки и 1% азида натрия. Нанесите на клетки антитело против CAR и промойте дважды. Окрашивайте клетки с помощью живого/мертвого окрашивания и моноклонального антитела CD3 (OKT3). Промойте ячейки и снова суспендируйте в буфере для потока. Сбор данных на цитометре для определения эффективности трансдукции.
4. Криоконсервация CAR-Т-клеток
   1. Для забора и криоконсервации CAR-Т-клеток через 8 дней после стимуляции (8-й день роста Т-клеток) необходимо извлечь клетки из культуры.
   2. Вращайте в течение 5 минут при 300 x g.
   3. Ресуспендировать в замораживающей среде в концентрации 10 миллионов клеток/мл на флакон в замораживающей среде, состоящей из 10% диметилсульфоксида и 90% фетальной бычьей сыворотки.
   4. Заморозьте в контейнере для заморозки до скорости охлаждения -1 °C/мин в морозильной камере при температуре -80 °C, а затем переложите на жидкий азот через 48 часов.
   5. Перед их использованием в экспериментах in vitro или in vivo разморозьте CAR T-клетки в теплой ТКМ.
   6. Промойте клетки для разбавления и удаления диметилсульфоксида и ресуспендирования до концентрации 2 x 10⁶ клеток/мл в теплой ТКМ. Отдых на ночь при температуре 37 °C, 5%_CO2.

2. Производство гранулоцитарного макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF ^k/o) CART19

1. Чтобы разрушить GM-CSF, используйте направляющую РНК (гРНК), нацеленную на экзон 3 GM-CSF человека (CSF2), отобранных с помощью скрининга, ранее сообщалось, что они обладают высокой эффективностью для гена CSF2, который кодирует цитокин человека GM-CSF.
   заметка: Была использована коммерчески синтезированная лентивирусная конструкция Cas9 третьего поколения исследовательского класса, содержащая эту гРНК (под промотором U6). Конструкция содержит ген устойчивости к пуромицину. Последовательность гРНК — GACCTGCCTACAGACCCGCC.
2. Для производства лентивируса используют клетки 293T, достигшие 70-90% конфлюенции.
3. Позволяют инкубировать 15 мкг представляющей интерес лентивирусной плазмиды, 18 мкг упаковочного вектора gag/pol/tat/rev, 7 мкг вектора оболочки VSV-G, 111 мкл реагента предварительного комплексообразования, 129 мкл реагента для трансфекции и 9,0 мл трансфекционной среды для инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре.
4. Добавьте к 293T-клеткам реагенты для трансфекции. В культуре при 37 °С, 5% углекислого газа (_СО2).
5. Соберите, центрифугируйте (900 x g в течение 10 мин), отфильтруйте (нейлоновый фильтр 0,45 μM) и концентрируйте надосадочную жидкость через 24 и 48 ч путем ультрацентрифугирования при 13 028 x g в течение 18 ч или 112 700 x g в течение 2 ч и заморозьте при -80 °C для дальнейшего использования.
6. В день 1 осторожно ресуспендируйте Т-клетки, чтобы разбить розетки.
7. В лаборатории, одобренной BSL-2+, добавьте замороженный или свежесобранный вирус к стимулированным Т-клеткам, чтобы получить CAR T-клетки. Трансдуцируйте Т-клетки с помощью лентивируса CAR19 и GM-CSF, нацеленного на лентивирус CRISPR. Добавьте лентивирус CAR19 при MOI 3. Поскольку титрование лентивируса CRISPR было невозможным, используйте вирусные частицы, полученные из плазмидного препарата размером 15 мкг, для трансдукции 10 x 10⁶ Т-клеток.
8. Ознакомьтесь с остальными этапами стимуляции, расширения и криоконсервации Т-клеток, как описано в шаге 1.
9. Для Т-клеток, отредактированных lentiCRISPR, несущих резистентность к пуромицину, обрабатывайте клетки дигидрохлоридом пуромицина в концентрации 1 мкг пуромицина на 1 мл в 3-й и 5-й дни.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
CD3 моноклональное антитело (OKT3), ТЭЛА, eBioscience	Инвитроген	12-0037-42
Моноклональное антитело к CD3 (UCHT1), APC, eBioscience	Инвитроген	Тел.: 17-0038-42
Выбор Taq Blue Мастермикс	Денвилл Сайентифик	C775Y51
CTS (Системы клеточной терапии) Dynabeads CD3/CD28	Gibco	40203Д
Система CytoFLEX B4-R2-V2	Бекман Коултер	С10343	Проточный цитометр
Диметилсульфоксид	Миллипора Сигма	D2650-100МЛ
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко	Gibco	14190-144
Dynabeads MPC-S (Концентратор магнитных частиц)	Прикладные биосистемы	А13346
Easy 50 Магнит EasySep	Технологии стволовых клеток	18002
EasySep Набор для изоляции Т-клеток человека	Технологии стволовых клеток	17951	Магнитные шарики с отрицательным отбором; 17951RF включает наконечники и буфер
Фетальная бычья сыворотка	Миллипора Сигма	Ф8067
FITC Мышь Анти-Человеческая CD107a	BD Pharmingen	No 555800
Фиксирующая среда (Medium A)	Инвитроген	GAS001S100
Конструкция гРНК GenCRISPR: Название: CSF2	GenScript	Н/Д	Пользовательский заказ
CRISPR направляющая РНК 1; Виды: Человек, Переносчики:
pLentiCRISPR v2; Резистентность: ампициллин; Номер копии:
высокий; Плазмидный препарат: Стандартная поставка: 4 мкг (Бесплатно
за плату)
Козье антимышиное антитело IgG (H+L) с перекрестной адсорбцией вторичного антитела, Alexa Fluor 647	Инвитроген	А-21235
https://tide.nki.nl.	Настольная генетика
Человеческая АБ сыворотка; мужчины-доноры; тип АВ; Нас	Корнинг	35-060-КИ
ИФН гамма-моноклональное антитело (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience	Инвитроген	47-7319-42
Липофектамин 3000 Реагент для трансфекции	Инвитроген	L3000075
LIVE/DEAD Исправимый набор для окрашивания Aqua Dead Cell, для возбуждения 405 нм	Инвитроген	Л34966
Лимфопреп	Технологии стволовых клеток	7851
Раствор Monensin, 1000X	Биолегенда	420701
Мышиный античеловеческий клон CD28 CD28.2	BD Pharmingen	No 559770
Мышиный античеловеческий клон CD49d 9F10	BD Pharmingen	561892
Мышиный античеловеческий MIP-1β PE-Cy7	BD Pharmingen	560687
Морозильный контейнер Mr. Frosty	Термо Сайентиал	5100-0001
NALM6, клон G5	АТКС	ЦРЛ-3273	Клеточная линия острого лимфобластного лейкоза
Вода, не содержащая нуклеазы	Компания Promega	Р119С
Вакуумные фильтрующие системы Olympus, 500 мл, мембрана PES, 0,22 мкМ, стерильная	Дженеси Сайентиал	25-227
Вакуумные фильтрующие системы Olympus, 500 мл, мембрана PES, 0,45 мкМ, стерильная	Дженеси Сайентиал	25-228
Opti-MEM I Средство для пониженной сыворотки (1X), жидкое	Gibco	31985-070 (Английский)
PE-CF594 Мышиный античеловеческий IL-2	BD Горизонт	562384
Пенициллин-стрептомицин-глютамин (100X), жидкость	Gibco	10378-016
Проникающая среда (Medium B)	Инвитроген	GAS002S100
Мини-набор PureLink Genomic DNA Mini Kit	Инвитроген	K182001
Пуромицина дигидрохлорид	Компания MP Biomedicals, Inc.	210055210
Набор для экстракции геля QIAquick	ЦИАГЕН	No 28704
Крысиный античеловеческий GM-CSF BV421	BD Горизонт	562930 (Английский
РобоСен-С	Технологии стволовых клеток	21000	Полностью автоматизированный сепаратор ячеек
СепМате-50 (ИВД)	Технологии стволовых клеток	No 85450
Азид натрия, 5% (мас./об.)	Рикка Кемикал	7144.8-16
X-VIVO 15 Бессывороточная гемопоэтическая клеточная среда	Лонза	04-418Q