Метод CRISPR-Cas9 для редактирования генов в Т-клетках

Аннотация

Источник: Агарвал, С., и др. Производство CAR-T-клеток человека, сконструированных CRISPR. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует анализ для выполнения редактирования генов в Т-клетках человека с использованием технологии CRISPR-Cas9. Смесь первичных CD4+ и CD8+ Т-клеток сочетается с рибонуклеопротеиновым комплексом CRISPR-Cas9, нацеленным на определенные гены для нокаута. При электропорации sgRNA направляет Cas9 к целевой последовательности ДНК, создавая точные разрезы. Эти порезы затем восстанавливаются с помощью негомологичного механизма соединения концов клетки, что приводит к нокауту гена.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Конструирование sgРНК и разрушение генов в первичных Т-клетках человека

1. Проектирование sgRNA's
   CRISPR заметка: Несколько серверов и программ облегчают конструирование специфичных для мишени одиночных направляющих РНК (sgRNA). В этом протоколе кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR) спроектированы с использованием CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) и портала дизайна гРНК от Института Броуда (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
   1. Для каждого гена-мишени спроектируйте от шести до десяти последовательностей sgРНК, которые будут нацелены на раннее кодирование последовательностей экзонов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: sgРНК должна иметь высокую целевую эффективность и низкую нецелевую эффективность. Каждый алгоритм машинного обучения для определения эффективности sgRNA работает немного по-разному. Поэтому рекомендуется сравнить несколько инструментов дизайна sgRNA и составить список из шести-десяти sgRNA для скрининга.
2. Разрушение генов в первичных Т-клетках человека
   1. Получение аутологичных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от здоровых доноров-добровольцев. Схематическая временная шкала протокола показана на рисунке 1A и описана ниже.
   2. Выделите CD4+ и CD8+ Т-клетки с помощью коммерчески доступных наборов для отбора CD4 и CD8.
   3. Объедините CD4+ и CD8+ Т-клетки в соотношении 1:1 и инкубируйте в течение ночи при концентрации 3x10⁶ клеток/мл в R10 с добавлением 5 нг/мл человеческого интерлейкина-7 (huIL-7) и человеческого интерлейкина-15 (huIL-15) каждая. Рекомендуется добавление IL-7 и IL-15, поскольку известно, что они способствуют центральному фенотипу памяти, а химерные антигенные рецепторы (CAR)-Т-клетки, расширенные с помощью IL-7 и IL-15, имеют более высокую противоопухолевую эффективность по сравнению с интерлейкином-2 (IL-2) расширенными CAR-T-клетками.
   4. На следующий день подсчитайте Т-клетки и центрифугируйте 5-10 x 10⁶ клеток при 300 x g в течение 5 мин. Выбросьте всю надосадочную жидкость и промойте клеточную гранулу в минимально необходимых средах с пониженным содержанием сыворотки. Суспендировать гранулу в 100 мкл нуклеофекционного раствора в соответствии с инструкцией производителя (Таблица материалов).
   5. Во время промывания клеток получить комплекс рибонуклеопротеина (РНП) с CRISPR-ассоциированным белком 9 (Cas9) и гРНК путем инкубации 10 мкг нуклеазы Cas9 с 5 мкг sgРНК в течение 10 мин при комнатной температуре (ОТ). Молярное отношение Cas9 к sgРНК составляет 1:2,4. Рекомендуется использовать имитацию контроля, содержащую Cas9 и усилитель электропорации, но не содержащую sgRNA.
      заметка: Мультиплексное редактирование генов может быть выполнено на этом этапе путем создания комплексов РНП для каждой мишени отдельно и объединения их с клетками во время нуклеофекции, как описано на следующем этапе. Выбор реагентов для сборки комплекса RNP является ключом к получению высокой эффективности нокаута (KO). Например, нуклеазы Cas9 от разных производителей имеют различные побочные эффекты, а химически модифицированная гРНК снижает токсичность для Т-клеток, тем самым повышая эффективность KO.
   6. Объедините ресуспендированные клетки из этапа 1.2.4 с комплексом RNP из этапа 1.2.5 и добавьте 4,2 мкл 4 μМ усилителя электропорации (олигонуклеотид одноцепочечной ДНК [ssDNA], который не гомологичен геному человека). Хорошо перемешайте и переложите в кюветы для электропорации. Избегайте образования пузырьков, так как они снижают эффективность электропорации.
   7. Электропорировать ячейки с использованием импульсного кода EH111. После электропорации инкубируют клетки в R10 с добавлением 5 нг/мл huIL-7 и huIL-15 в концентрации 5x10⁶ клеток/мл при 30 °C в течение 48 ч в 12-луночных планшетах. Через 48 ч приступают к активации и расширению Т-клеток.

Результаты

Рисунок 1. Увеличение количества отредактированных CAR-T-клеток и удвоение их популяции. (А) Хронология редактирования и производства CRISPR в первичных клетках CART человека. (B) Удвоение популяции в CAR-T-клетках CD19 с помощью Mock и CRISPR-edited, измеренное с помощью счетчика Култера во время экспансии CAR-T-клеток (n=3 здоровых доноров; KO=нока...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ядро 4D-нуклеофактора	Лонза	ААФ-1002Б
4D-нуклеофактор X-единицы	Лонза	ААФ-1002Х
Cas9-Усилители электропорации	IDT	1075915
Набор для выделения CD4+ Т-клеток	Технологии стволовых клеток	15062
Комплект для выделения CD8+ Т-клеток	Технологии стволовых клеток	15063
Вакуумный фильтр/бутылка Corning 0,45 микрон	Корнинг	430768
Колба для клеточных культур Corning T150	Миллипора Сигма	CLS430825
DNAeasy Набор для крови и тканей	Цягэн	69504
Добавка с глутамаксом	ТермоФишер	35050061
ГЕПЕС (1 М)	ТермоФишер	15630080
-15	ПепроТех	200-15
-7	ПепроТех	200-07
Липофектамин 2000	ТермоФишер	11668019
Opti-MEM	ТермоФишер	31985062
P3 Первичная клетка 4D-нуклеофактор X Kit L	Лонза	В4ХП-3024
Пенисилин-стрептомицин-глутамин	ТермоФишер	10378016
RPMI1640	ТермоФишер	12633012
sgRNA	IDT
Шпионский Fi Cas9	Альдеврон	9214

гг.