Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Содержание и обслуживание мышей
- Приобретите 6-8-недельных мышей NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ).
- Содержание мышей в условиях SPF с воздухообменом, предварительными фильтрами и высокоэффективными воздушными фильтрами твердых частиц (0,22 мкм) в помещении с контролируемой температурой, влажностью и давлением.
- Размещение и содержание мышей в автоклавных индивидуальных микроизоляторах в штативной системе, способной управлять воздухообменом с помощью фильтров предварительной очистки и фильтров HEPA (0,22 мкм).
- Выполняйте все процедуры и манипуляции с мышами в вытяжном шкафу класса II типа А2, который был предварительно обработан 70% этанолом. Перед работой в комнате для животных примите душ и переоденьтесь в чистые скрабы, костюм Тайвек, бахилы, шапочку для волос, маску для лица и перчатки. Во время хирургических процедур надевайте операционный халат поверх костюма Tyvek.
заметка: Перед процедурами также предпочтительно проводить обеззараживание ультрафиолетовым (УФ) светом.
- По возможности автоклавируйте все инструменты и реагенты, а затем продезинфицируйте их перед переносом в вытяжной шкаф.
- Во время процедур снимайте индивидуально вентилируемые клетки животных со стеллажа и дезинфицируйте их перед переносом в вытяжной шкаф.
- Кормите мышей облученным кормом и обеспечьте автоклавной водой. Обеспечьте облученный корм и дополняйте его дополнительным облученным кормом по мере необходимости. Меняйте воду в автоклаве еженедельно или по мере необходимости. <чел/>
заметка: Также можно использовать автоклавированную подкисленную воду. Срок годности облученного рациона составлял 6 месяцев после изготовления.
2. Генерация гуманизированных мышей из костного мозга, печени и тимуса (BLT)
ПРИМЕЧАНИЕ: Поколение мышей hu-BLT было описано ранее.
- В день операции сделайте мышам облучение всего тела в дозе 12 сГр/г массы тела.
- Подготовьте мышей к операции.
- Дайте каждой облученной мыши смесь кетамина в рабочей концентрации 100 мг/кг и ксилазина в концентрации 12 мг/кг, которая варьировалась от 130-170 мкл на мышь в зависимости от массы тела, путем внутрибрюшинного (IP) введения для анестезии. Для приготовления 3 мл смеси кетамина и ксилазина добавьте 0,27 мл кетамина в исходной концентрации 100 мг/мл и 0,03 мл ксилазина в концентрации от 100 мг/мл до 2,7 мл стерильного физиологического раствора и хорошо перемешайте. Перед инъекцией продезинфицируйте кожу 70% изопропанолом.
- Дайте каждой облученной мыши бупренорфин 1 мг/кг массы тела (период полувыведения 72 ч, SR-LAB) подкожно для длительного обезболивания.
- Дайте каждой облученной мыши 100 мкл (858 мкг) цефазолина путем внутриинъекционного введения для предоперационной антибиотикопрофилактики.
- Сбрейте шерсть мышей с помощью электрических машинок для стрижки волос вокруг левой боковой и медиальной стороны мыши в месте последующего хирургического вмешательства, используемого для обнажения левой почки.
- Проверьте надлежащий уровень анестезии с помощью педального рефлекса (твердое защемление пальца ноги).
- Дайте изофлуран в концентрации 3-5%, если требуется дополнительная анестезия в любой момент операции.
- Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы. При необходимости наклейте ушную бирку.
- Проведите операцию по имплантации тканей печени и тимуса в капсулу левой почки.
- Продезинфицируйте кожу в месте операции, нанося йодный скраб, начиная от центра хирургического участка и двигаясь к внешней стороне по кругу. Повторите этот процесс с 70% изопропанолом и третий раз с йодом.
- С помощью щипцов сначала загрузите в троакар один фрагмент ткани печени плода человека. Затем с помощью щипцов загрузите в троакар один фрагмент ткани тимуса плода человека. Затем с помощью щипцов загрузите в троакар еще один фрагмент ткани печени плода человека. Салфетки следует обрезать на 1-1,6мм3, чтобы они соответствовали внутренним размерам троакара.
- С помощью щипцов подтяните кожу и с помощью ножниц сделайте небольшой надрез в продольном направлении. Удлините срез на 1,5-2 см с левой стороны мыши.
- С помощью щипцов приподнимайте мышечный слой и с помощью ножниц сделайте небольшой надрез в продольном направлении. При необходимости удлините разрез, чтобы обнажить почку.
- Обнажите почку, осторожно захватывая жировую ткань, окружающую почку. Не прикасайтесь непосредственно к паренхиме почки.
- Сделайте разрез 1-2 мм на заднем конце капсулы почки с помощью скальпеля.
- Медленно введите предварительно нагруженный троакар через разрез параллельно длинной оси почки и освободите ткани между капсулой почки и почкой.
- Осторожно верните почку и кишечник в нормальное положение. Используйте рассасывающиеся шовные материалы 5/0 P-3 (P-13) с круговой иглой 3/8 диаметром 13 мм для закрытия мышечного слоя и хирургическими скобами для закрытия кожи.
- После операции поместите мышь в чистую автоклавную клетку микроизолятора для восстановления.
- Чтобы свести к минимуму потерю тепла во время послеоперационного восстановления, поместите клетку с мышами на грелку, которая подключена к водяному насосу, который нагревает и циркулирует воду.
- Наблюдайте за мышами до тех пор, пока они не придут в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.
- В течение 6 ч после завершения операции через хвостовую вену ввести CD34+ гемопоэтические стволовые клетки, выделенные из ткани печени плода человека.
- Согрейте мышей с помощью тепловой лампы. Продезинфицируйте хвост 70% изопропанолом, а затем введите в хвостовую вену от 1,5 до 5 × 105 стволовых клеток/200 μл.
- Остановите кровотечение от инъекции и верните мышей в клетку микроизолятора, а клетку микроизолятора — в стойку для клетки.
заметка: Мышей после операции обычно размещают вместе, по пять человек в клетке микроизолятора, во время и после восстановления. Тем не менее, мышей размещают вместе только в том случае, если все они получили операцию в один и тот же день.
- Проверяйте мышей ежедневно. Внимательно следите за хирургическими скобами и заменяйте их по мере необходимости. Внимательно следите за мышами на предмет любых признаков инфекции или дискомфорта. Подавайте автоклавный корм на пол микроизолятора в течение нескольких дней после операции.
- Удалите хирургические скобы через 7-10 дней после операции. Дайте газ изофлуран в концентрации 3-5% для обезболивания мышей. Осторожно удалите скобы, а затем нанесите на участок антибиотик и обезболивающую мазь.
- Дайте 9-12 недель для восстановления иммунных клеток человека, затем соберите периферическую кровь из медиальной подкожной вены у каждой из гуманизированных мышей.
- Удерживайте мышей, находящихся в сознании, с помощью пластикового конуса соответствующего размера с отверстием возле головки мыши для дыхания и отверстием возле задней части мыши для изоляции одной ноги. Поместите мышей в удерживающий конус сначала головой, а затем осторожно протяните одну ногу через отверстие для ноги.
- Распылите на медиальную сторону изолированной ноги 70% изопропанола, затем нанесите антибиотик и обезболивающую мазь на то же место.
заметка: Мазь помогает выявить расположение вены без необходимости удаления волос, а также способствует образованию капель крови.
- С помощью иглы 25 калибра под углом 90° проколите вену и соберите 50-100 мкл крови с помощью пробирки для сбора крови, покрытой этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА). Остановите кровотечение, придавив к участку стерильной марлей. Как только кровотечение прекратится, верните мышей в клетку.
заметка: Максимальный объем собираемой крови обычно составляет 50 мкл в неделю или 100 мкл каждые две недели.
- По собранной периферической крови проверяют уровень восстановления иммунных клеток человека с помощью проточной цитометрии с антителами к hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.
3. Лечение антибиотиками
- Перед лечением антибиотиками соберите образцы кала перед обработкой. Переместите мышей в новую клетку с автоклавным микроизолятором.
- Ежедневно готовьте свежий коктейль из антибиотиков широкого спектра действия.
- Приготовьте 250 мл воды, содержащей свежеприготовленный метронидазол (1 г/л), неомицин (1 г/л), ванкомицин (0,5 г/л) и ампициллин (1 г/л) для каждой микроизоляторной клетки мышей. <бр/>
заметка: Используйте автоклавную или стерильную воду для питьевой воды, дополненной антибиотиками.
- Добавьте 9,2 г подслащенной смеси для напитков с виноградным сахаром в 250 мл воды, обогащенной антибиотиком.
заметка: Использование подслащенной смеси для напитков с виноградным сахаром маскирует горький вкус антибиотиков и помогает предотвратить обезвоживание у мышей.
- Меняйте антибиотик и подслащенный виноградным сахаром напиток, смешивайте с добавлением воды и ежедневно помещайте мышей в новую автоклавную клетку.
заметка: Мыши находятся в копрофагическом состоянии, и ежедневная смена клеток не позволяет мышам повторно прививать себя кишечными бактериями.
- Для максимального приживления микробиома кишечника, подобного человеческому, обеспечьте антибиотиками в течение 14 дней. Во время лечения антибиотиками следите за мышами на предмет потери веса и обезвоживания. Потеря веса ожидается в течение первых 3-4 дней и стабилизация после этого на протяжении всего лечения. Если происходит обезвоживание, дайте мышам физиологический раствор или раствор Рингера через внутрибрюшинную инъекцию.
заметка: Другие протоколы гуманизации кишечного микробиома предусматривают пероральное зондирование антибиотиков. Несмотря на то, что он эффективен в истощении кишечных бактерий мышей, мы обнаружили, что менее инвазивный метод добавления антибиотиков в питьевую воду оказывает меньший стресс на наших гуманизированных мышей и приводит к лучшим результатам.
4. Образцы донора и трансплантация кала
- Подготовьте образцы кала донора человека.
- Используйте надлежащим образом подготовленные источники материала для трансплантации фекальной микробиоты (ТФМ) для трансплантации кала гуманизированным мышам.
- Разморозьте препараты ТФМ и аликотируйте их в анаэробных условиях в анаэробной камере.
- При желании на этом этапе смешайте равные части образцов кала вместе, чтобы создать непредвзятый «человеческий» образец.
- Сведите замораживание и размораживание материала FMT к минимуму, если аликвотирование или смешивание образцов не требуется, размораждайте только непосредственно перед процедурой.
- Трансплантация фекалий человека
- После завершения 14-дневного лечения антибиотиками смените питьевую воду на автоклавную воду и переместите мышей в новую автоклавную клетку. Прекратите ежедневную смену клеток и внедрите график смены клеток раз в 1-2 недели.
- Проведите две фекальные трансплантации через 24 и 48 часов после прекращения приема антибиотиков.
- Через 24 ч после лечения антибиотиками разморозьте необходимое количество материала ТФМ и дайте каждой мыши 200 мкл материала ТФМ через зонд. Повторите процедуру снова через 48 ч после приема антибиотиков.
- Разложите остатки или остатки размороженного материала FMT на шерсть гуманизированных мышей или на подстилку клетки.
