Создание поливалентной вакцины против везикул с наружной мембраной

Abstract

Источник: Feng, R., et al. Платформа вакцины на основе наночастиц "plug-and-display" на основе везикул внешней мембраны, отображающих рецептор-связывающий домен SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2022).

Это видео демонстрирует метод создания поливалентных вакцин на основе внешних мембранных везикул (OMV). Клетки млекопитающих трансфицируются для экспрессии и секреции вирусных антигенов, слитых со SpyTag и полигистидиновой меткой. Затем эти антигены очищают с помощью аффинной колонки никель-нитрилотриуксусной кислоты (Ni-NTA). Очищенный антиген смешивают с везикулами внешней мембраны, экспрессирующими поверхностно связанный белок SpyCatcher (SC). Множественные антигены ковалентно прикрепляются к SpyCatchers через свои SpyTags (ST), создавая OMI, которые отображают антиген, выступая в качестве поливалентной вакцины.

Protocol

1. Конструкция плазмиды

1. Вставьте ДНК, кодирующую последовательность SpyCatcher (рис. 1), в ампициллин-резистентную плазмиду pThioHisA-Cytolysin A (ClyA) (см. Таблицу материалов) между сайтами BamH I и Sal I для создания плазмиды pThioHisA ClyA-SC в соответствии с ранее опубликованным отчетом.
2. Лигируйте синтезированный ген слияния рецептор-связывающего домена (RBD)-полигистидиновой метки (Histag) синтезированного SpyTag-SARS-CoV-2 (Рисунок 1) в плазмиду pcDNA3.1 (см. Таблицу материалов) между сайтами BamH I и EcoR I для конструирования плазмиды pcDNA3.1 RBD-ST в соответствии с ранее опубликованным отчетом.

2. Подготовка к OMV-SC

1. Выполните преобразование ClyA-SC, выполнив следующие действия.
   1. Добавьте 5 мкл раствора плазмиды pThioHisA ClyA-SC (50 нг/мкл) к 50 мкл соответствующего штамма BL21, осторожно подуйте и дайте остыть на льду в течение 30 минут.
   2. Поместите раствор на 90 с на водяную баню при температуре 42 °C, а затем сразу же поставьте смешанный раствор на лед на 3 минуты.
   3. Добавьте 500 мкл среды Лурия-Бертани (LB) в бактериальную суспензию и, после смешивания, культивируйте при 220 об/мин при 37 °C в течение 1 ч.
   4. Перенесите всю трансформацию на агаровую пластину LB, содержащую ампициллин (100 мкг/мл, см. Таблицу материалов) и закваливайте в течение ночи при 37 °C.
      заметка: В последующих экспериментах ампициллин поддерживали в той же концентрации в среде. В противном случае это может привести к потере плазмид в бактериях.
2. Для производства OMV-SC выполните следующие действия.
   1. Выделите одну колонию из планшета (шаг 2.1.4.) до 20 мл LB (устойчивой к ампициллину) среды и закваливайте в течение ночи при 220 об/мин при 37 °C.
   2. Инокулируйте бактериальный раствор (начиная с шага 2.2.1) в среду объемом 2 л, культивируйте при 220 об/мин, 37 °C в течение 5 ч до стадии логарифмического роста (наружный диаметр₆₀₀нм составляет от 0,6 до 0,8).
   3. Когда ОД при 600 нм бактериального раствора достигает 0,6-0,8, добавляют изопропилбета-D-тиогалактопиранизид (ИПТГ, см. Таблицу материалов), чтобы конечная концентрация бактериального раствора составила 0,5 мМ, а затем культивируют в течение ночи при 220 об/мин при 25 °С.
3. Проведите очистку OMV-SC.
   1. Центрифугируйте бактериальный раствор при температуре 7 000 x g при 4 °C в течение 30 минут.
   2. Надосадочную жидкость отфильтровать с помощью мембранного фильтра 0,22 мкм, затем сконцентрировать ее с помощью ультрафильтрационной мембраны с усилием 100 кД или колонки из полых волокон (см. Таблицу материалов).
   3. Отфильтруйте концентрат через мембранный фильтр 0,22 мкм, затем центрифугируйте его при 150 000 x g при 4 °C в течение 2 ч с помощью ультрацентрифуги (см. Таблицу материалов) и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
   4. Повторно суспендируйте осадки с помощью PBS и храните их при температуре −80 °C. Решение может поддерживать долговременную стабильность при температуре −80 °C.

3. Подготовка RBD-ST

1. Выполните трансфекцию RBD-ST, выполнив следующие действия.
   1. Выберите подходящую эукариотическую систему экспрессии (например, HEK293F) и культивируйте клетки в течение ночи при 130 об/мин при 37 °C после восстановления.
   2. Добавьте 20 мкл раствора HEK293F клеток в автоматический счетчик клеток (см. Таблицу материалов), запишите количество клеток, отрегулируйте концентрацию до 1 x 106 клеток/мл, а затем культивируйте клетки при 130 об/мин при 37 °C в течение 4 ч.
   3. Профильтровать плазмиду RBD-ST через мембранный фильтр 0,22 мкм и добавить 300 мкг плазмид в среду для культивирования клеток (см. Таблицу материалов) до конечного объема 10 мл; встряхнуть в течение 10 с.
   4. Нагреть полиэтиленимин (ПЭИ, 1 мг/мл, см. Таблицу материалов) до 65 °С на водяной бане, смешать 0,7 мл ПЭИ с 9,3 мл среды для клеточных культур и периодически встряхивать в течение 10 с.<бр/> заметка: Не стоит сильно встряхивать раствор. В противном случае образующиеся пузырьки могут повлиять на эффективность трансфекции.
   5. Добавьте раствор плазмиды в раствор PEI, периодически встряхивайте смесь в течение 10 с и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 15 минут.
   6. Добавьте смесь в 280 мл среды для культивирования клеток и культивируйте при 130 об/мин при 37 °С в течение 5 дней.
2. Проведите очистку RBD-ST.
   1. Центрифугируйте клетки при температуре 6 000 x g при 25 °C в течение 20 минут и с помощью пипетки собирайте надосадочную жидкость.
   2. Заполните колонку 2 мл агарозы Ni-NTA (см. Таблицу материалов) и промойте ее 3 раза 3x PBS.
   3. Добавьте имидазол (см. Таблицу материалов) в надосадочную жидкость ячейки до конечной концентрации 20 мМ, и загрузите надосадочную жидкость в 2 раза.
   4. Добавьте 3 объема колонки (CV) PBS, содержащую 20 мМ имидазола для промывки, и соберите промывочную фракцию.
   5. Градиентное элюирование с 3 CV PBS, содержащим низкие и высокие концентрации (например, 0,3 М, 0,4 М, 0,5 М) имидазола; элюирование 2x для каждой концентрации.
   6. Используйте SDS-PAGE для идентификации RBD-ST при различных градиентах концентрации.

4. Биоконъюгация и очистка OMV-RBD

1. Определяют концентрацию белка методом анализа бицинхониловой кислоты (БЦА) (см. Таблицу материалов).
   1. Последовательно разбавьте стандартный раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) с 2 мг/мл до 0,0625 мг/мл, разведите очищенные OMV-SC и RBD-ST 10x, затем смешайте рабочие растворы BCA A и B (предоставленные в наборе для анализа) в соотношении 50:1 (v/v).
   2. Добавьте разбавленный раствор белка (25 μл/лунка) и смешайте с рабочим раствором BCA (200 μл/лунку), инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
   3. Измерьте абсорбцию (OD) на длине волны 562 нм каждой лунки и рассчитайте концентрацию белка по стандартной кривой.
2. Выполните биоконъюгацию OMV-SC и RBD-ST, выполнив следующие действия.
   1. Смешивайте OMV-SC и RBD-ST в PBS в соотношении 40:1 (w/w).
   2. Вертикально поверните, чтобы смешать смесь в течение ночи при 15 об/мин при 4 °C.
      заметка: Разные антигены могут реагировать в разных пропорциях. Можно попробовать различные соотношения реакций в зависимости от характеристик антигена.

Results

Рисунок 1: Последовательности плазмид, использованные в настоящем исследовании.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ампициллин натрия	Сангон Биотех	A610028
Автоматический счетчик ячеек	Графская звезда	Биотехнологии
Набор для количественного определения белка BCA	CWBIO	CW0014S
Аппарат для электрофореза	Кавой	Пауэр БВ
Высокоскоростная центрифуга для замораживания	Биоридж	Н2500Р
Мышь His-Tag mAb	Технология клеточной сигнализации	2366с
Имидазол	Сангон Биотех	A600277
Изопропилбета-D-тиогалактопиранозид	Сангон Биотех	A600118
Ni-NTA His-Bind Superflow	Цягэн	70691
Среда для культивирования клеток OPM-293	Опм бионауки	81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST плазмида	Уханьская генетическая биологическая технология
Фосфатный буферный раствор	ЗСГБ-биография	ЗЛИ-9061
Полиэтиленимин линейный	Полинауки	No 23966-1
Предварительно окрашенная белковая лестница	термо	No 26616
Плазмида pThioHisA ClyA-SC	Уханьская генетическая биологическая технология
Настольные системы Quixstand (колонна из полого волокна 100 кД)	GE Healthcare
Буфер загрузки SDS-PAGE (5x)	Бейотим	П0015
Хлорид натрия	Сангон Биотех	A100241
Подвесной прибор	Технологии Life	Гула-микшер
Триптон	Оксоидный	LP0042B
ультрацентрифуга	Сошник Бекмана	ХПН-100
Ультрафиолетовый спектрофотометр	Хитачи	У-3900
Дрожжевой экстракт	Сангон Биотех	A610961