Модель интерпозиции аорты мыши для изучения аллоиммун-индуцированного сосудистого отторжения

Abstract

Источник: Enns, W., et al. Мышиная модель аллоиммун-индуцированного отторжения сосудов и трансплантатного артериосклероза. J. Vis. Exp. (2015).

Это видео демонстрирует метод создания модели интерпозиции аорты мыши для изучения аллоиммун-индуцированного отторжения сосудов. После установки мыши-донора под наркозом в положение лежа на спине, инфраренальная брюшная аорта (ИУК) тщательно изолируется от окружающих структур. Ветвящиеся сосуды перевязываются, и оба конца ИУК зажимаются для предотвращения кровотока перед резекцией. Впоследствии донорская ИУК имплантируется аллогенной мыши-реципиенту, и кровоток восстанавливается с помощью анастомоза для исследования аллоиммунного индуцированного отторжения сосудов.

Protocol

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

Используйте мышей-доноров Balb/cYJ (H2^d) и мышей-реципиентов C57Bl/6 (H2^b) для изучения аллогенных реакций. Мыши используются для экспериментов в возрасте от 8 до 12 недель. Используйте мышей женского или мужского пола. Сингенный контроль состоит из сегментов аорты от доноров C57Bl/6 к реципиентам C57Bl/6.

1. Подготовка донора и реципиента

ПРИМЕЧАНИЕ: И донор, и реципиент обезболиваются и готовятся перед операцией, чтобы свести к минимуму ишемию трансплантата. Инъекционные анестетики используются в протоколе для предотвращения обструкции животного оборудованием, необходимым для доставки ингаляционных анестетиков. Тем не менее, при желании ингаляционный анестетик является подходящей альтернативой. С момента первоначального введения анестетиков вся процедура занимает около 90 минут. Время ишемии трансплантата составляет менее 30 минут.

1. Обезболивайте мышей внутрибрюшинными инъекциями кетамина (100 мг/кг; 10 мг/мл) и ксилазина (10 мг/кг; 1 мг/мл). Мышь будет успокоена в течение 10-15 минут. Оцените глубину анестезии, защемляя жировую часть подушечки лапы животного. Вводите 1/3 от первоначальной дозы анестетического коктейля по мере необходимости, пока у животного не проявится рефлекс отмены. Внимательно следите за частотой дыхания после каждого приема коктейля. Во время операции оценивайте уровень анестезии каждые 15 минут, зажимая переднюю брюшную стенку парой щипцов. Мыши должны оставаться под глубокой анестезией в течение 60-90 минут.
2. Смажьте глаза мыши офтальмологической мазью, чтобы предотвратить сухость во время пребывания под анестезией.
3. Сбрейте волосы как можно ближе к коже в брюшной вентральной области от середины грудной клетки до лобка. Будьте особенно осторожны, чтобы не поцарапать кожу. Не используйте крем для депиляции, так как он может впитываться в кожу и вызывать воспаление.
4. Положите животное лежа на полотенце над греющим столиком или подушкой.
5. Очистите место операции с помощью предварительного скраба с 2% хлоргексидином. Подготовьте большую рабочую зону, чтобы максимально увеличить операционное поле. Начинайте скрабирование в центре операционного участка и двигайтесь наружу линейно или по кругу. Утилизируйте марлю. Повторите эту процедуру еще не менее 5 раз. Приложите спиртовую губку к тому же участку. Как только спирт высохнет, подготовьте чистый участок раствором Бетадина и накиньте его стерильной марлей.

2. Процедура сквозного анастомоза

1. Донорская операция
   1. Поддерживайте асептическую технику на протяжении всей операции. Перед использованием очистите все поверхности столешниц и хирургических столов 0,5% раствором ускоренной перекиси водорода. Перед использованием оберните и автоклавируйте все хирургические инструменты, марли, портьеры и халаты. Проверьте стерильность инструментов с помощью индикаторной полоски парового стерилизатора, помещенной в каждую упаковку. Стерильные хирургические перчатки используются и утилизируются между операциями. При проведении нескольких операций стерилизуйте хирургические инструменты между их использованием с помощью стерилизатора для шариков из горячего стекла.
   2. Поместите мышь-донора лежа на чистую тонкую доску из плексигласа, обернутую стерильной простыней, под операционный микроскоп при 8-30-кратном увеличении.
   3. После обеспечения адекватной хирургической анестезии, как указано в разделе 1.1, приступайте к операции.
   4. С помощью стерильных ножниц сделайте одиночный срединный нижний продольный разрез живота, от лобка до ксухоидного отростка.
   5. Откройте брюшные стенки, чтобы обнажить полость с помощью небольшого ретрактора.
   6. С помощью стерильных аппликаторов с ватным наконечником аккуратно втяните кишечник вверх влево от животного и накройте марлей, смоченной в физрастворе. Сдвиньте репродуктивные органы вниз и расположите инфраренальную аорту и нижнюю полую вену (НПВ). Периодически увлажняйте открытые ткани солевым раствором.
   7. С помощью медицинских щипцов No5 отделить аорту от НПВ, от уровня левой почечной артерии до бифуркации. Используйте полиамидные монофиламентные нити 10-0 для перевязки небольших ветвей возле аорты.
   8. После отделения аорты донора от НПВ пропитайте сосуд физиологическим раствором, накройте открытую полость увлажненной марлей и отложите донора в стерильную зону. Проверяйте состояние донора (дыхательную и сердечно-сосудистую функцию и глубину анестезии) каждые 15 минут. Начните оперировать реципиента, изолируя аорту, как описано ниже (шаги с 2.2.1 по 2.2.7).
   9. После того, как аорта реципиента была отделена от НПВ и отложена в сторону, верните донора под микроскоп. Поперечный зажим (проксимальнее и дистальнее исследуемого сегмента) донорской аорты, примерно на расстоянии 5 мм друг от друга, с помощью двух микрососудистых зажимов по 4 мм.
   10. С помощью микроножниц Vannas-Tubingen пересеките небольшой сегмент трансплантата (длиной от 3 до 4 мм) брюшной аорты.
   11. С помощью иглы 25 G 5/8, прикрепленной к шприцу, промыть иссеченную аорту гепаринизированным (100 Ед/мл) физиологическим раствором. Следите за тем, чтобы кончик иглы не соприкасался с сосудом.
   12. Поместите аорту в гепаринизированный (100 Ед/мл) солевой раствор на лед и отложите в сторону. Находясь под глубокой анестезией, освободите микрососудистые зажимы. Усыпьте донора путем обескровливания.
   13. Имплантат донорского сосуда должен быть имплантирован в течение 30 минут после иссечения. Несмотря на то, что можно использовать один донорский сосуд для нескольких реципиентов путем иссечения аорты большей длины, время ишемии должно составлять менее 30 минут.
2. Операция с получателем
   1. Поддерживайте асептическую технику на протяжении всей операции, как при донорской операции.
   2. Поместите мышь получателя лежа на тонкой плексигласовой доске, обернутой стерильной простыней, под операционный микроскоп при 8-30-кратном увеличении.
   3. После обеспечения адекватной анестезии приступайте к операции, когда у животного не проявляется рефлекс отмены.
   4. С помощью стерильных ножниц сделайте одиночный срединный нижний продольный разрез живота, от лобка до ксухоидного отростка.
   5. Откройте брюшные стенки, чтобы обнажить полость с помощью небольшого ретрактора.
   6. С помощью стерильных аппликаторов с ватным наконечником аккуратно втяните кишечник вверх влево от животного и накройте марлей, смоченной в физрастворе. Переместите репродуктивные органы вниз и расположите инфраренальную аорту и НПВ. Периодически увлажняйте открытые ткани солевым раствором.
   7. Отделить аорту от НПВ, от уровня левой почечной артерии до бифуркации. При необходимости используйте полиамидные монофиламентные шовные материалы 10-0 для перевязки небольших ветвей возле аорты.
   8. Поперечный зажим (проксимальнее и дистальнее интересующего сегмента) аорты, расположенный примерно на расстоянии 5 мм друг от друга, с помощью двух микрососудистых зажимов диаметром 4 мм.
   9. С помощью микроножниц Vannas-Tubingen сделать одну горизонтальную аортотомию и резецировать небольшой сегмент (не более 0,5 мм) брюшной аорты для размещения донорского аортального трансплантата.
   10. Промойте иссеченную аорту гепаринизированным (100 Ед/мл) физиологическим раствором. Донорский аортальный трансплантат должен иметь достаточную длину, чтобы соединить пересеченные концы аорты реципиента.
   11. Поместите донорский аортальный трансплантат в ортотопическое положение и анастомизируйте конец донорского трансплантата к концу реципиента, сопоставляя анатомическую ориентацию соответствующего трансплантата с ориентацией реципиента.
   12. Аккуратно обхватите внешнюю оболочку сосуда и слегка отклоните ее с помощью медицинских щипцов No5. С помощью щипцов проведите иглу, прикрепленную к полиамидному монофиламентному шву 10-0, по всей толщине стенки сосуда, чтобы закрепить донорский аортальный трансплантат к резецированному сосуду реципиента. Следите за тем, чтобы отверстие в сосуде не было закрыто из-за случайного наложения швов на заднюю стенку сосуда.
   13. Для непрерывных швов наложите швы в положении «9 часов» как на верхнем, так и на нижнем концах трансплантата. Начиная с верхнего конца трансплантата с 3 часов, анастомозируйте резецированные концы 2 ходящими швами и закрепите шов на оставшемся шве.
       1. Переверните трансплантат и продолжайте наложение шва на дорсальную часть сосуда, встречаясь с исходным швом. Закрепить без особого давления на сосуд. Повторите наложение швов на нижний анастомоз.
          Примечание: Прерывистые швы начинаются так же, как и непрерывные швы, за исключением того, что сосуд анастомозируется тремя отдельными швами между оставшимися швами. Время анастомоза обычно составляет 20 минут.
   14. После того, как анастомоз будет завершен, отпустите дистальный микрососудистый зажим, чтобы позволить ретроградной крови течь, и проверьте наличие утечки из анастомозированных участков. Если есть протекание, немедленно наложите швы, чтобы закрыть дефектный участок. Если в местах нет кровотечения, освободите проксимальный зажим.
   15. Осмотрите трансплантат и убедитесь, что в трансплантате, а также в проксимальном и дистальном отделах сосуда реципиента нет закупорки крови. Интенсивный пульс в сосудах донора и реципиента указывает на то, что кровь течет свободно. С помощью пары щипцов аккуратно возьмитесь за один конец швов и слегка выверните сосуд, чтобы осмотреть заднюю стенку сосуда><. заметка: Не должно быть сморщения стенки сосуда с обоих концов анастомозированных участков. Плохой кровоток после снятия зажимов является признаком тромбоза.
   16. Верните кишечник в брюшную полость с помощью аппликаторов с ватным наконечником.
   17. С помощью иглодержателя Castroviejo и щипцов Graefe закройте брюшную стенку полипропиленовыми швами 5-0 с помощью непрерывного шва. Закройте слой кожи теми же швами с помощью подкожного закрытия.
   18. Вводите Тортугезик (1 мг/кг) в/м сразу после завершения трансплантации.
   19. Дайте немедленно, в заказе, Атипамезол (1 мг/кг), кетопрофен (5 мг/кг) и подогретый раствор Лактата Рингера подкожно.
   20. Сразу после операции поместите мышей в отапливаемую клетку под водяное одеяло на ночь (12 часов). В период обезболивающе-восстановительного периода поместите животных одних в чистое, сухое, беспрепятственное место. Выстелите клетку (автоклавную) чистыми бумажными полотенцами и отрегулируйте температуру водяного одеяла примерно до 20-22 °C. Обеспечьте сухими и влажными гранулами в неограниченном количестве на полу клетки.
       заметка: Важным компонентом послеоперационного ухода является наблюдение за животным и соответствующее вмешательство, при необходимости, во время восстановления после анестезии и операции. Необходимая интенсивность мониторинга будет варьироваться в зависимости от животного и может быть выше в течение непосредственного периода восстановления после анестезии, чем позже в послеоперационном восстановлении.
   21. Постоянно наблюдайте за животными, перенесшими анестезию, пока они полностью не выздоровеют. Животное должно быть в состоянии поддерживать лежачее положение грудины без посторонней помощи, и оно должно выглядеть спокойным и свободным от боли, прежде чем его оставят без присмотра.
   22. Давайте бупренорфин (0,1 мг/кг СВД) и кетопрофен (5 мг/кг СВД) в течение трех дней, оба подкожно.
   23. Контролируйте сердечно-сосудистую и дыхательную функцию, температуру тела, а также послеоперационные боли или дискомфорт во время восстановления после анестезии в течение не менее трех дней. Может потребоваться дополнительная помощь, такая как введение анальгетиков и других препаратов и парентеральных жидкостей, чтобы свести к минимуму обезвоживание и потерю электролитов.
   24. Оцените успешность операции по трансплантации, наблюдая за двигательной функцией задних конечностей. Полный успех трансплантации включает в себя беспрепятственный приток крови к задним конечностям и хвосту, что должно быть немедленно после выздоровления животного, и полное выздоровление без паралича задних конечностей на второй день.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J (H-2b)	Лаборатории Джексона, Бар-Харбор, штат Мэн	Штамм # 000664
Balb/cBYJ	Лаборатории Джексона, Бар-Харбор, штат Мэн	Штамм # 001026
Кетамина гидрохлорид для инъекций USP 100 мг/мл	Кеталян	ДИН 00612316
Ксилазин для инъекций 20 мг/мл	Ромпум	ДИН 02169592
Кетопрофен для инъекций 100 мг/мл	Анафен	ДИН 01938126
Буторфанол тартрат для инъекций 10 мг/мл	Торгугезик	ДИН 008450000
Бупренорфин для инъекций 0,3 мг/мл	Рекитт Бенкизер	Б.Н. 5241
Атипамезола гидрохлорид стерильный раствор для инъекций	Антиседан	ДИН 02237744
Гепарин натрия для инъекций, USP, 1000 ед./мл	Дистрибуция McKesson	ДИН 02264315
Слезы натуральная офтальмологическая мазь	Алкон	ДИН 02082519
Стереомикроскоп	Лейка	М80
0,9% натрия хлорид, стерильный	Корпорация «Бакстер»
Раствор Рингера лактатный, стерильный	Корпорация «Бакстер»
0,9% натрия хлорид для инъекций, стерильный, 10 мл	Корпорация «Бакстер»
Подушечки для приготовления алкоголя	Лорис
Повидон-йод	Бетадин
Хлоргексидина глюконат 4% по мас./v	Герми-Стат
Черная полиамидная мононить	AROSurgical Instruments	T4A10Q07
Шовный материал, шовный материал 10-0, 70 мкм	корпорация
Синяя монофиламентная нить шовная 5-0, игла P3	Этикон	8698Г
1 мл шприца	БД	ССЫЛКА 309659
10 мл Шприц	БД	ССЫЛКА 309604
Шприц с инсулином 1cc TB с 28G 1/2	БД	ССЫЛКА 309309
25G 7/8, игла для подкожных инъекций	БД	ССЫЛКА 305124
27G 1/2, игла для подкожных инъекций	БД	ССЫЛКА 305109
Втягивающий ретрактор Colibri - разброс 1,5 см 4 см	Инструменты для точной науки	17000-04
S&T CAF-4 Зажим для наложения щипцов, без замка	Инструменты для точной науки	00072-14 (Английский)
Щипцы Supergrip, S&T	Инструменты для точной науки	00632-11
Щипцы медицинские No5	Инструменты для точной науки	11253-20
Детские ножницы Lexer	Инструменты для точной науки	14078-10
Щипцы Micro Adson зазубренные	Инструменты для точной науки	11018-12
Микроножницы Vannas-Tubingen	Инструменты для точной науки	15003-08
Микрозажимы, b-1; 3,5 мм x 1 мм; длина 7 мм	Инструменты для точной науки	00396-01 (Английский
Щипцы Graefe, 10 см 1x2 зубца	Инструменты для точной науки	11054-10
Castroviejo с замком и вольфрамовыми губками	Инструменты для точной науки	12565-14
Стерилизатор шариков из горячего стекла	Инотех 250	ИС-250 - Steri-250
Нетканые марли	Проген
Аппликаторы с хлопковыми наконечниками	пуританин
Триммер для бороды	Валь
Грелку	солнечный луч