Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Хирургическая подготовка, анестезия и режим анальгезии
- Положите стерильную одноразовую простыню (45,7 см x 66 см) на операционную платформу. Осторожно возьмите мышь, введите кетамин (50 мг/кг) и ксилазин (10 мг/кг) внутрибрюшинно (в/в) для анестезии и введите 0,05 мг/кг бупренорфина подкожно для обезболивания.
- Обеспечьте глубину анестезии с помощью пальцев ног, сбрейте бритвой волосы во всей области живота и поместите мышь на стерильную операционную платформу под операционным микроскопом при 6-10-кратном увеличении.
2. Забор донорской селезенки
- Простерилизуйте брюшную полость спиртовой салфеткой, закрепите конечности хирургическим пластырем, а ножницами сделайте вертикальный разрез кожи по средней линии от лобка до мечевидного отростка.
- Втяните брюшную стенку с помощью стерильных ретракторов, изготовленных из скрепок. Переместите кишечник на правый фланг брюшной полости (левую сторону хирурга) стерильным ватным тампоном, чтобы обнажить селезенку. Прижгите короткую желудочную вену, прикрепленную к селезенке, стерильным низкотемпературным прижиганием (рис. 1А). Положите на селезенку кусок стерильной марли, смоченной в физиологическом растворе 37 °C, чтобы она оставалась влажной (рисунок 1B).
- Отделите и мобилизуйте воротную вену от ткани поджелудочной железы (рисунок 1C) путем перевязки ветвей воротной вены (верхняя панкреатодуоденальная вена и правая желудочная вена); наложите шов вокруг воротной вены дистальнее селезеночной вены (рисунок 1D).
- Переверните селезенку в правую сторону, чтобы обнажить аорту и чревный ствол с селезеночной артерией (рисунок 1E). Рассекайте и мобилизуйте аортально-целиакическую и селезеночную артерию путем перевязки печеночной артерии и желудочной артерии; наложите шов вокруг аорты проксимальнее чревной артерии (рисунок 1F-G).
- Введите 100 международных единиц (МЕ) гепарина в нижнюю полую вену (НПВ) для гепаринизации всего тела и подождите 3 минуты, чтобы обеспечить эффект гепарина. Перевязать аорту проксимальнее чревной артерии, пересечь воротную вену, а затем перфузировать все тело с помощью 10 мл гепаринизированного холодного (4 °C) физиологического раствора (10 мл/20 с) из брюшной аорты дистальнее чревного ствола (рис. 1H).
- Соберите трансплантат селезенки en bloc с соответствующим аорто-целиакическим сегментом и воротной веной вместе с сегментом селезеночной вены и небольшим участком ткани поджелудочной железы. Перед пересадкой храните трансплантат в 5 мл физиологического раствора 4 °C. Усыпите мышь при вывихе шейки матки.
3. Спленэктомия реципиента и имплантация трансплантата селезенки
- Положите грелку на операционную платформу и отрегулируйте температуру до 37 °C. Поместите стерильную простыню (45,7 см x 66 см) поверх грелки, чтобы создать стерильную хирургическую платформу. Повторите шаги 2.1 и 2.2 для хирургической подготовки и обезболивания. Сделайте разрез по средней линии 3-4 см и втяните брюшную стенку, как описано в шаге 2.1 и шаге 2.2.
- Осторожно переместите кишечник в правую сторону мыши с помощью стерильного ватного тампона, чтобы обнажить селезенку реципиента. Перевязайте селезеночную вену и артерию и удалите селезенку.
- Осторожно переместите кишечник на левую сторону мыши и накройте кишечник влажной марлей (смоченной стерильным физиологическим раствором 37 °C). Рассекают и перевязывают поясничные ветви инфраренальной аорты и НПВ; Перекрестный зажим инфраренальной аорты и НПВ с помощью двух микрососудистых зажимов диаметром 4 мм.
- Наложите нейлоновый шов 11-0 через инфраренальную аорту (на всю толщину) и втяните для создания эллиптической аортотомии одним разрезом микроножницами (длина должна соответствовать диаметру донорской аорты, рис. 2A). Проколите НПВ иглой 30 G, чтобы создать эллиптическую венотомию, и продлите отверстие до согласованной длины донорской воротной вены с помощью микроножниц (Рисунок 2A).
- Очистите внутрипросветную кровь или тромб (в аорте и НПВ) с помощью 500 мкл гепаринизированного физиологического раствора (10 ЕД/мл).
- Поместите трансплантат селезенки на правом фланге брюшной полости мыши реципиента; тщательно определите аортальную манжету донора и воротную вену донора. Убедившись, что сосуды не перекручены, накройте трансплантат селезенки марлей, смоченной в холодном (4 °С) физрастворе.
- Соедините аортальную манжету донора с проксимальной и дистальной верхушками аортаотомии реципиента двумя остающимися швами (нейлоновый шов 11-0, такой же, как ниже) (рис. 2B, C). Сделайте анастомоз с помощью 2-3 укусов непрерывных нейлоновых швов 11-0 между аортальной манжетой донора и аортотомией (передней стенкой) реципиента (рисунок 2D). Переверните трансплантат селезенки на левую сторону реципиента; провести анастомоз между аортальной манжетой донора и аортотомией (задней стенкой) реципиента (рисунок 2E).
- Выполните анастомоз для соединения воротной вены донора с задней стенкой НПВ реципиента, используя от 4 до 5 укусов непрерывных швов на внутренней стороне НПВ, а затем закройте шов с внешней стороны НПВ (Рисунок 2F, G).
- Освободите зажимы сосудов и используйте стерильный ватный тампон для тампонадного кровотечения до тех пор, пока цвет селезенки не восстановится (рисунок 2H).
- Закройте живот синтетическим рассасывающимся викриловым швом 5-0 непрерывным способом. Закройте слой кожи нейлоновым швом 5-0 в прерывистом узоре.
заметка: Для шагов 3.7-3.8, в качестве альтернативы, сначала сделайте анастомоз между воротной веной донора и НПВ реципиента (шаг 3.8); Затем сделайте анастомоз между аортальной манжетой донора и задней стенкой аортотомии реципиента, используя от 2 до 3 непрерывных швов внутри аорты и закройте шов с внешней стороны аорты.
4. Восстановление животных
- Введите 1 мл теплого физиологического раствора подкожно через 4 отдельных места (0,25 мл/место) после закрытия брюшной полости.
- Держите мышь в инкубаторе с регулируемой температурой (30 °C) в течение первых нескольких часов после операции, наблюдайте за мышью, пока она не придет в сознание, а затем переложите мышь в новую чистую клетку с обычным кормом и водой, с грелкой (30 °C) под клеткой. После операции держите мышь в отдельной клетке.
5. Послеоперационное обезболивание
- Введите 0,05 мг/кг бупренорфина подкожно через 24 ч и 48 ч после операции для поддержания режима обезболивания.
