$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Получение количественных запасов глицерина Bacillus Calmette-Guerin (BCG) датской и Mycobacterium tuberculosis H37Rv
ПРИМЕЧАНИЕ: Все описанные протоколы были выполнены в условиях уровня биобезопасности-3 (BSL3).
- Замороженные запасы глицерина датских штаммов БЦЖ или H37Rv разморозить и ввести 100 мкл в 10 мл среды 7H9 с добавлением Tween-80 0,05% (v/v) и ADC (альбумин, декстроза, каталаза) 10% (v/v).
- Инкубировать в статических условиях в течение одной недели при 37 °C до тех пор, пока культура не перейдет в логарифмическую фазу роста.
- Увеличьте масштаб бактериальной культуры, перенеся 10-мл культуры в 200 мл свежей среды. Инкубировать еще 20 дней в статических условиях.
- Переложите в центрифужные пробирки объемом 50 мл и центрифугуйте в течение 15 минут при давлении 2500 x g.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте бактериальную гранулу в остаточном объеме. Добавьте в каждую пробирку стерильные стеклянные шарики диаметром 3 мм (10 - 15 на пробирку).
- Энергично переведите вихрь в течение 1 минуты, чтобы диссоциировать бактериальные комки. Ресуспендируйте каждую гранулу в 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) с Tween-80 0,05% (v/v).
- Оставьте пробирки на 10 минут, чтобы основные бактериальные агрегаты и стеклянные шарики остыли.
- Извлеките 9,5 мл надосадочной жидкости из каждой из 4 пробирок, содержащих небольшие комочки и отдельные бактерии, и переложите объемы в одну свежую центрифужную пробирку объемом 50 мл (окончательный восстановленный объем 38 мл). Центрифуга в течение 10 мин при 400 x g.
- Соберите 35 мл надосадочной жидкости (содержащей в основном одиночные бактерии) в одной свежей центрифужной пробирке объемом 50 мл и добавьте 15 мл PBS с глицерином 50% (v/v), получив конечную концентрацию глицерина 15% (v/v).
- Аккуратно перемешайте и распределите по 1 мл аликвоты в соответствующих пробирках для заморозки. Хранить при температуре -80 °C (на одну партию приходится примерно 50 аликвот глицеринового запаса).
- Чтобы количественно определить запасы глицерина, разморозьте глицерин на следующий день после замораживания и выполните семь десятикратных серийных разведений в отдельных пробирках объемом 1,5 мл, содержащих 900 мкл PBS.
- Планшет 100 мкл каждого разбавления в среде твердого агара 7H10 с добавлением ADC 10% (v/v) приготовлен в чашках Петри диаметром 55 мм.
- Осторожно добавьте стеклянные шарики диаметром 3 мм (прибл. 10 на пластину) и осторожно встряхните пластину, чтобы равномерно распределить объем по агаровой пластине. Выбросьте шарики и заклейте агаровую пластину парапленкой.
- Инкубируйте в течение 21 дня при 37 °C и определяйте концентрацию бактерий путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) в разведениях, где можно точно различить отдельные колонии.
2. Вакцинация мышей
- Разморозьте предварительно определенный глицерин БЦЖ и разведите его в PBS для получения двух суспензий. Расчет конечного объема с учетом дозы на одно животное составляет 100 мкл при подкожном введении (10,7 КОЕ/мл при подкожной вакцинации) и 40 μл при интраназальном введении (2,5 х 10,7 КОЕ при интраназальной вакцинации).
- Используйте специализированную анестезиологическую рабочую станцию для грызунов, чтобы обезболить мышей смесью изофлурана и кислорода. Используйте изофлуран 5% для индукции анестезии и 2% для поддержания мышей в анестезиологической камере. (Можно использовать и другие принятые методы анестезии).
- Для подкожного введения вакцины наполните шприц объемом 1 мл с иглой 26 G 1 мл бактериальной суспензии (107 КОЕ/мл). Удалите пузырьки воздуха.
- Поместите мышь, находящуюся под наркозом, на плоскую поверхность в положении лежа внутри колпака с ламинарным потоком и введите подкожно 100 мкл (106 КОЕ/доза) вакцины в боковую часть спины мыши. Верните мышь в клетку и следите за ней, чтобы убедиться, что она правильно восстанавливается после анестезии.
- Меняйте иглу шприца между каждым введением мыши. Удаляются пузырьки воздуха, как описано выше.
- Для интраназального введения поместите обезболенную мышь в лежачем положении внутри капюшона.
- С помощью микропипетки возьмите 20 μл суспензии с концентрацией 2,5 x 107 КОЕ/мл. Капля за каплей поместите инокулянт между двумя ноздрями, пока весь объем не будет отложен, оставляя время между каплями, чтобы мышь могла вдохнуть объем.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши могут страдать от респираторного дистресса во время этой процедуры, поэтому им следует дать им усвоить каждую каплю перед введением следующей, чтобы максимально предотвратить это.
- Снова наполните микропипетку еще 20 мкл и повторите операцию. Если мышь начинает просыпаться от анестезии после первой прививки, поместите ее в анестезиологическую камеру до второй. Верните мышь в клетку и убедитесь, что она правильно восстановилась после анестезии.
3. Интраназальное заражение мышей штаммом H37Rv
- Разморозьте предварительно определенный глицерин H37Rv и разведите его в PBS для получения бактериальной суспензии с концентрацией 2500 КОЕ на мл. Рассчитайте конечный объем, учитывая, что доза на животное составляет 40 мкл.
- H37Rv инокулируют интраназально, как описано в пунктах 2,5 - 2,7. Конечная провокационная доза на одну мышь составляет 102 КОЕ/40 μл.