Генерация распространенной демиелинизации коры головного мозга в модели крысы

Аннотация

Источник: Üçal, M. et al., Крысиная модель широко распространенной демиелинизации коры головного мозга, вызванной внутримозговой инъекцией провоспалительных цитокинов. J. vis. Exp. (2021)

Видео демонстрирует метод создания модели крысы с широко распространенной демиелинизацией коры головного мозга. Это включает в себя нарушение гематоэнцефалического барьера путем введения провоспалительных цитокинов мышам, заряженным рекомбинантным белком миелиновой оболочки. Этот процесс способствует инфильтрации иммунных клеток, что приводит к распространенной демиелинизации коры головного мозга.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовка материала

ПРИМЕЧАНИЕ: Операция проводится в асептических условиях. Перед началом работы убедитесь, что все хирургические инструменты, включая сверла, очищены соответствующим дезинфицирующим средством.

1. Приготовьте смесь обезболивающего: 0,02 мг/мл фентанила, 0,4 мг/мл мидазолама и 0,2 мг/мл медетомидина (конечные концентрации в смеси). <бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите соответствующий раздел «Обсуждение» для альтернативных анестетиков.
2. Приготовьте антидотную смесь: 0,07 мг/мл флумазенила и 0,42 мг/мл атипамезола (конечные концентрации в смеси).
3. Соберите катетер и колпачок катетера с помощью впускного отверстия и винта. Разрежьте катетер скальпелем на длину 2 мм (рис. 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте для этого ножницы, так как они сжимают и искажают круглую форму поперечного сечения кончика катетера.

2. Подготовка к операции

1. Обезболить крысу путем внутрибрюшинного введения анестезирующей смеси (1,5 мл/кг массы тела).
2. Выбрейте голову крысы между ушей с помощью электробритвы. Поместите гомеотермическое одеяло на стереотаксическую раму перед размещением животного, чтобы избежать переохлаждения на протяжении всей операции.
3. Обездвижите голову крысы в стереотаксической рамке с помощью ушных планок и прикусочной пластины, следя за тем, чтобы голова находилась горизонтально и устойчиво. Проверьте стабильность, надавливая на череп пальцем или щипцами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слабая фиксация и негоризонтальное расположение в стереотаксической системе могут привести к отклонению от предполагаемых координат.
4. Нанесите смазывающие глазные капли, чтобы предотвратить сухость роговицы во время операции. Накройте глаза непрозрачным материалом, чтобы предотвратить воздействие хирургического света.
5. Очистите выбритый участок, чередуя нанесение 70% этанола и 10% повидон-йодного комплекса. <бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте все меры предосторожности во время операции, чтобы избежать инфекции. Операция проводится в асептических условиях. Если асептика нарушена, то загрязненный материал необходимо заменить.

3. Имплантация катетера

1. Сделайте продольный надрез длиной около 2 см посередине кожи головы. Используйте бульдожьи зажимы, чтобы удерживать кожу в стороны. Обзор этих шагов приведен на рисунке 2.
2. Удалите кровь с помощью аппликатора с ватным наконечником.
3. Удалите надкостницу черепа. Очистите ткань аппликатором с ватным наконечником и обнажите кость черепа. Дайте черепу высохнуть в течение примерно 1 минуты.
4. Определите анатомические ориентиры, лямбду, брегму и медиальный шов. Установив сверло на стереотаксическую раму, расположите наконечник сверла в Брегме в качестве начальной точки. Переместите на 2 мм назад от брегмы и переместите ~2,4 мм латерально к медиальному шву.
5. В этом положении просверлите отверстие диаметром 0,5 мм для катетера. Аккуратно смыть костную пыль.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы твердая мозговая оболочка оставалась неповрежденной во время сверления. Чтобы обеспечить это, 1) используйте дрель, которую можно установить на стереотаксическую раму, 2) часто осматривайте отверстие во время сверления и 3) сверлите небольшими шагами. Если на череп оказывается слишком большое давление, кончик сверла продолжит проникать внутрь и повреждать мозг, когда череп будет полностью пробит
.
6. Просверлите еще 3 отверстия (~1,3 мм в диаметре) для анкерных винтов в нескольких миллиметрах от первого отверстия. Аккуратно сдуйте костную пыль.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите места для анкерных винтов, которые обеспечивают достаточно места для верхней части катетера (диаметр ~2 мм) и верхней части анкерных винтов (~1 мм).
7. Удалите костную пыль путем орошения примерно 1–2 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) или физиологического раствора с помощью шприца. Очистите череп. Затяните анкерные винты на 2 - 3 полных оборота. <бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Анкерные винты необходимы для стабилизации установки путем удержания стоматологического цемента и, таким образом, катетера на месте. Затягивая анкерный винт, убедитесь, что его нелегко снять, осторожно подняв его вверх с помощью щипцов. Поскольку имплантация катетера сама по себе вызывает травму тканей, дополнительное повреждение твердой мозговой оболочки при сверлении или затяжке анкерных винтов приведет к множественным травматическим повреждениям и, возможно, затруднит сопоставимость в пределах одной группы. Сначала затяните анкерные винты, а затем вставьте катетер.
8. Вставьте катетер длиной 2 мм через первое отверстие, перпендикулярно поверхности черепа. Все еще удерживая катетер, нанесите немного стоматологического цемента и дайте ему полимеризоваться с кратким (~ 5 с) воздействием стоматологического лечебного света для стабилизации катетера, что позволит использовать обе руки на следующем этапе.
   осторожность: При работе с стоматологическим лампой избегайте взгляда прямо на кончик или на свет, отраженный от области нанесения, так как высокая интенсивность этого света может привести к повреждению сетчатки. Используйте соответствующие защитные очки.
9. Нанесите больше стоматологического цемента вокруг катетера, закрепите винты и затвердейте стоматологический цемент с помощью стоматологического лечебного света (~15 - 30 с). Подтвердите затвердевание цемента кончиком щипцов.

4. Закрытие раны и антагонизация анестезии

1. Закройте кожу головы рассасывающимися швами, спереди и сзади от катетера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку в конце имплантации над черепом будет неровная конструкция, выполните соответствующее закрытие раны. Слишком сильное поднятие кожи приведет к дискомфорту для животного.
2. Введите антидотную смесь подкожно (1,5 мл/кг массы тела) с помощью шприца объемом 1 мл с иглой 26 G.
3. Назначают энрофлоксацин (2,5%) путем подкожного введения (7,5 мг/кг массы тела) для профилактического лечения антибиотиками. Введите карпрофен (1 мг/мл; 5 мг/кг массы тела) и бупренорфин (1,2 мг/кг) для облегчения боли путем подкожного введения.

5. Послеоперационный уход и лекарства

1. Верните животное в модифицированную клетку и держите его под наблюдением в течение 1 - 3 часов, применяя инфракрасный свет во избежание переохлаждения. Постоянно наблюдайте и перемещайте животное каждые 5 - 10 минут до послеоперационного восстановления. Соблюдайте особую осторожность, чтобы избежать постоянного воздействия света на глаза до выздоровления.
2. Повторите введение энрофлоксацина (7,5 мг/кг массы тела) и карпрофена (1 мг/мл; 5 мг/кг массы тела) путем подкожных инъекций на следующий день после операции. Бупренорфин не нуждается в обновлении, так как предыдущее лечение эффективно в течение 72 часов.

6. Приготовление иммунизационной смеси (не ранее чем через 14 дней после имплантации катетера)

ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите шприцы на лед во время процедуры подготовки.

1. Подсоедините два стеклянных шприца со стопорным наконечником Люэра объемом 10 мл к коротким рычагам 3-ходового запорного крана и закройте третье выходное отверстие длинным рычагом.
2. Убедитесь, что соединения надежны и герметичны: добавьте примерно 4 мл стерильного PBS в открытый шприц, удерживая поршень 2. Вставьте поршень 1 и толкайте оба поршня вперед и назад, проверяя герметичность. Если утечки не происходит, выбросьте PBS и снова снимите поршень 1.
3. Пипетку 1 мл неполного адъюванта Фрейнда (ИФА) и 50 мкг рекомбинантного гликопротеина миелина олигодендроцитов (rMOG_1-125) вместе и отрегулируйте смесь до конечного объема 2 мл со стерильным PBS (pH 7,4) в подходящей пробирке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за потерь эмульсии на кончиках или стенках шприцев во время приготовления приготовьте больший объем, чем предназначен для введения. Точно так же практичнее готовить более чем 1 животное одновременно.
4. Разведенную смесь ИФА и рМОГ_1-125 поместите в открытый шприц. Осторожно вставьте поршень, сохраняя слабое давление на противоположный поршень (Рисунок 3A).
5. Эмульгируйте инокулюм, перемещая его от одного шприца к другому, толкая поршни вперед и назад до тех пор, пока он не станет белым и вязким (Рисунок 3B).
6. Закрепите шприц с замком Люэра объемом 1 мл на открытом коротком рычаге 3-ходового запорного крана и заполните его инокулюмом (рис. 3C). Распределите весь инокулюм по 1 мл шприцев. Держите его на льду до момента укола. Вводите смесь в день приготовления.

7. Иммунизация

1. Анестезируйте крысу изофлураном в камере (~2 мин, смешанный с кислородом 2 л/мин), а затем выдержите анестезию через маску (смешанную с кислородом 1,5 л/мин).
2. Введите 200 μл инокулюма подкожно у основания хвоста с помощью иглы 21 G.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вводите инъекцию медленно, так как раствор вязкий.

8. Внутримозговая инъекция цитокинов

1. Отрегулируйте длину соединительной канюли (2 мм). (Шаги подготовки см. на рисунке 4.)
2. Наполните шприц 1 мл смесью цитокинов (500 нг/мкл фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-альфа), 300 ЕД/мкл рекомбинантного интерферона-гамма крысы (ИФН-гамма) в стерильном ПБС). Подсоедините шприц к соединительной канюле. Заполните канюлю цитокиновой смесью. Избегайте образования пузырей.
3. Установите шприц на программируемый шприцевой насос и запрограммируйте его на впрыскивание 0,2 μл/мин (Рисунок 5A). Запустите насос и поддерживайте его в рабочем состоянии, чтобы избежать образования пузырьков воздуха на кончике канюли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость инъекции должна учитывать внутренний диаметр конкретного используемого шприца; Таким образом, диаметр шприца должен быть зарегистрирован во время настройки насоса.
4. Обезболите крысу изофлураном в камере (~2 мин, смешанные с 2 л/мин кислорода), а затем выдержите анестезию через маску (смешанную с 1,5 л/мин кислорода) (Рисунки 5B и 5C). Нанесите смазывающие глазные капли, так как животное будет находиться под наркозом не менее 30 минут.
5. Снимите колпачок катетера с впускным отверстием. Вставьте соединительную канюлю в катетер, закрутите и затяните ее (рисунки 5D и 5E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не затягивайте его слишком сильно, так как это разрушит верхний кончик катетера.
6. Дайте инъекции продолжаться в течение 10 минут (общий объем инъекции составляет 2 мкл). Остановите насос. Оставьте канюлю внутри катетера на 20 минут, чтобы введенный объем полностью диффундировал.
7. Открутите соединительную канюлю и медленно снимите ее, чтобы избежать эффекта вакуума.
8. Снова прикрепите колпачок катетера к входному отверстию и закрутите его. Дайте животному восстановиться после анестезии в клетке.

Результаты

Рисунок 1: Подготовка катетера. (А и Б) Направляющая канюля и фиктивная канюля (колпачок катетера с входом) собраны и завинчены. (В) Затем катетер разрезается до размера 2 мм с помощью скальпеля. Микроскопическое наблюдение показало, что использование ножниц для этой цели искажает круглую форму кончика канюли, и, следовательно, следует избегать.

...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Взрослый самец темных крыс агути (300 ±25 г)
Фентанил	Hameln pharma plus, Германия		В виде фентанил-цитрата, 50 мкг/мл
Мидазолам	ERWO Pharma, Австрия	50039017	5 мг/мл
Медетомидин	Orion Pharma, Финляндия		В виде медетомидина гидрохлорида, 1 мг/мл
Флумазенил	Roche, Швейцария		0,1 мг/мл
Атипамезол	Orion Pharma, Финляндия		В виде атипамезола гидрохлорида, 5 мг/мл
10% повидон-йодный комплекс	Mundipharma, Австрия
Стоматологический цемент	Гереус Кульцер, Германия	Тел.: 6603 7633
Физиологический раствор	Фрезениус Каби, Австрия		0,9% NaCl
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Sigma-Aldrich, Германия	П3813
Изофторан	AbbVie, Австрия
Смазывающие глазные капли	Thea Pharma, Австрия
70% EtOH	Merck, Германия	1070172511	Абсолютный этанол разводили в ddH2O для получения 70% v/v
2,5% энрофлоксацин	Bayer, Германия		Профилактические антибиотики
Карпрофен	Pfizer, США		Обезболивающие, 50 мг/мл
Подросток-20	Sigma-Aldrich, Германия	П9416
Пентобарбитал	Richter Pharma, Австрия		Пентобарбитал натрия, 400 мг/мл
Интерферон гамма	PeproTech, США	400-20
Фактор некроза опухоли альфа	R&D Systems, США	510-РТ-050/КФ
рМОГ1-125	собственный продукт в Центре молекулярной медицины, Каролинский институт, Швеция		Рекомбинантный гликопротеин миелина олигодендроцитов крысы, аминокислоты 1-125 с N-конца, также коммерчески доступный: AnaSpec, AS-55152-500, США
Неполный адъювант Фрейнда	Sigma-Aldrich, Германия	Ф5506
Бычий сывороточный альбумин	Sigma-Aldrich, Германия	А9576
Раствор пероксидазного субстрата	Vector Laboratories, США	СК-45000
Стереотаксический кадр	David Kopf Instruments, США
Подходят катетеры, МРТ	PlasticsOne, США	8IC315GPKXXC
Фиктивные канюли	PlasticsOne, США	8IC315DCNSPC
Пластиковые винты, подходят для МРТ	PlasticsOne, США	8Л080С093Н01
Соединительная канюля	PlasticsOne, США	8IC313CXSPCC
Отвертка с наконечником 2 мм
Дрель с гибким удлинителем вала	Proxxon, Германия	NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620,
Сверло, круглое, 0,5 мм	Hager & Meisinger, Германия	REF310 104 001 001 009
Сверло, скрученное, 1,3 мм	Hager & Meisinger, Германия	REF350 104 417 364 013
скальпель	Браун, Германия	ВВ510
Рукоятка скальпеля	Fine Science Tools, Германия	91003-12
Аппликатор с ватным наконечником	Генри Шайн Медикал, Австрия	900-3155
Хирургические ножницы	Fine Science Tools, Германия	14101-14, 14088-10
Хирургические щипцы	Fine Science Tools, Германия	11002-12, 11251-35
Зажимы Bulldog	Fine Science Tools, Германия	18050-35
Гомеотермическое одеяло	TSE systems, Германия
Инфракрасная лампа	Beurer, Германия	616.51
Стоматологический отверждающий свет	Гуйлинь Дятел Медикал, Китай
Рассасывающийся шовный материал	Johnson & Johnson, Бельгия	В792Е
Программируемый шприцевой насос	World Precision Instruments, США	АЛ-1000
Смотровые перчатки
Хирургический халат
Электробритвы	Эскулап, Германия	ГТ420
Испаритель летучих анестетиков	Rothacher Medical, Швейцария	КВ 30-301-Д
Источник кислорода для испарителя летучего анестетика	Air Liquide, Австрия	19 113
Летучая анестезиологическая камера	Rothacher Medical, Швейцария	ПС-0347
Маска для анестезии для крыс	Rothacher Medical, Швейцария	ПС-0307-А
1 мл шприц	Codan, Дания	КОД 62.1612
Игла калибра 26 для инъекций	Браун, Германия	4657683
Игла 20 калибра для инъекций цитокинов и иммунизации	Браун, Германия	4657519
Стеклянные шприцы с наконечником Luer lock	Poulten & Graf, Германия	7.140-37
3-х ходовой запорный кран	Бектон Дикинсон, Швеция	394600 (Английский
Инкубатор 37°C	Кендро, Германия	50042301
Микропипетки	Гилсон, США	F167350