Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка материала
ПРИМЕЧАНИЕ: Операция проводится в асептических условиях. Перед началом работы убедитесь, что все хирургические инструменты, включая сверла, очищены соответствующим дезинфицирующим средством.
- Приготовьте смесь обезболивающего: 0,02 мг/мл фентанила, 0,4 мг/мл мидазолама и 0,2 мг/мл медетомидина (конечные концентрации в смеси). <бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите соответствующий раздел «Обсуждение» для альтернативных анестетиков.
- Приготовьте антидотную смесь: 0,07 мг/мл флумазенила и 0,42 мг/мл атипамезола (конечные концентрации в смеси).
- Соберите катетер и колпачок катетера с помощью впускного отверстия и винта. Разрежьте катетер скальпелем на длину 2 мм (рис. 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте для этого ножницы, так как они сжимают и искажают круглую форму поперечного сечения кончика катетера.
2. Подготовка к операции
- Обезболить крысу путем внутрибрюшинного введения анестезирующей смеси (1,5 мл/кг массы тела).
- Выбрейте голову крысы между ушей с помощью электробритвы. Поместите гомеотермическое одеяло на стереотаксическую раму перед размещением животного, чтобы избежать переохлаждения на протяжении всей операции.
- Обездвижите голову крысы в стереотаксической рамке с помощью ушных планок и прикусочной пластины, следя за тем, чтобы голова находилась горизонтально и устойчиво. Проверьте стабильность, надавливая на череп пальцем или щипцами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слабая фиксация и негоризонтальное расположение в стереотаксической системе могут привести к отклонению от предполагаемых координат.
- Нанесите смазывающие глазные капли, чтобы предотвратить сухость роговицы во время операции. Накройте глаза непрозрачным материалом, чтобы предотвратить воздействие хирургического света.
- Очистите выбритый участок, чередуя нанесение 70% этанола и 10% повидон-йодного комплекса. <бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте все меры предосторожности во время операции, чтобы избежать инфекции. Операция проводится в асептических условиях. Если асептика нарушена, то загрязненный материал необходимо заменить.
3. Имплантация катетера
- Сделайте продольный надрез длиной около 2 см посередине кожи головы. Используйте бульдожьи зажимы, чтобы удерживать кожу в стороны. Обзор этих шагов приведен на рисунке 2.
- Удалите кровь с помощью аппликатора с ватным наконечником.
- Удалите надкостницу черепа. Очистите ткань аппликатором с ватным наконечником и обнажите кость черепа. Дайте черепу высохнуть в течение примерно 1 минуты.
- Определите анатомические ориентиры, лямбду, брегму и медиальный шов. Установив сверло на стереотаксическую раму, расположите наконечник сверла в Брегме в качестве начальной точки. Переместите на 2 мм назад от брегмы и переместите ~2,4 мм латерально к медиальному шву.
- В этом положении просверлите отверстие диаметром 0,5 мм для катетера. Аккуратно смыть костную пыль.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы твердая мозговая оболочка оставалась неповрежденной во время сверления. Чтобы обеспечить это, 1) используйте дрель, которую можно установить на стереотаксическую раму, 2) часто осматривайте отверстие во время сверления и 3) сверлите небольшими шагами. Если на череп оказывается слишком большое давление, кончик сверла продолжит проникать внутрь и повреждать мозг, когда череп будет полностью пробит .
- Просверлите еще 3 отверстия (~1,3 мм в диаметре) для анкерных винтов в нескольких миллиметрах от первого отверстия. Аккуратно сдуйте костную пыль.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите места для анкерных винтов, которые обеспечивают достаточно места для верхней части катетера (диаметр ~2 мм) и верхней части анкерных винтов (~1 мм).
- Удалите костную пыль путем орошения примерно 1–2 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) или физиологического раствора с помощью шприца. Очистите череп. Затяните анкерные винты на 2 - 3 полных оборота. <бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Анкерные винты необходимы для стабилизации установки путем удержания стоматологического цемента и, таким образом, катетера на месте. Затягивая анкерный винт, убедитесь, что его нелегко снять, осторожно подняв его вверх с помощью щипцов. Поскольку имплантация катетера сама по себе вызывает травму тканей, дополнительное повреждение твердой мозговой оболочки при сверлении или затяжке анкерных винтов приведет к множественным травматическим повреждениям и, возможно, затруднит сопоставимость в пределах одной группы. Сначала затяните анкерные винты, а затем вставьте катетер.
- Вставьте катетер длиной 2 мм через первое отверстие, перпендикулярно поверхности черепа. Все еще удерживая катетер, нанесите немного стоматологического цемента и дайте ему полимеризоваться с кратким (~ 5 с) воздействием стоматологического лечебного света для стабилизации катетера, что позволит использовать обе руки на следующем этапе.
осторожность: При работе с стоматологическим лампой избегайте взгляда прямо на кончик или на свет, отраженный от области нанесения, так как высокая интенсивность этого света может привести к повреждению сетчатки. Используйте соответствующие защитные очки.
- Нанесите больше стоматологического цемента вокруг катетера, закрепите винты и затвердейте стоматологический цемент с помощью стоматологического лечебного света (~15 - 30 с). Подтвердите затвердевание цемента кончиком щипцов.
4. Закрытие раны и антагонизация анестезии
- Закройте кожу головы рассасывающимися швами, спереди и сзади от катетера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку в конце имплантации над черепом будет неровная конструкция, выполните соответствующее закрытие раны. Слишком сильное поднятие кожи приведет к дискомфорту для животного.
- Введите антидотную смесь подкожно (1,5 мл/кг массы тела) с помощью шприца объемом 1 мл с иглой 26 G.
- Назначают энрофлоксацин (2,5%) путем подкожного введения (7,5 мг/кг массы тела) для профилактического лечения антибиотиками. Введите карпрофен (1 мг/мл; 5 мг/кг массы тела) и бупренорфин (1,2 мг/кг) для облегчения боли путем подкожного введения.
5. Послеоперационный уход и лекарства
- Верните животное в модифицированную клетку и держите его под наблюдением в течение 1 - 3 часов, применяя инфракрасный свет во избежание переохлаждения. Постоянно наблюдайте и перемещайте животное каждые 5 - 10 минут до послеоперационного восстановления. Соблюдайте особую осторожность, чтобы избежать постоянного воздействия света на глаза до выздоровления.
- Повторите введение энрофлоксацина (7,5 мг/кг массы тела) и карпрофена (1 мг/мл; 5 мг/кг массы тела) путем подкожных инъекций на следующий день после операции. Бупренорфин не нуждается в обновлении, так как предыдущее лечение эффективно в течение 72 часов.
6. Приготовление иммунизационной смеси (не ранее чем через 14 дней после имплантации катетера)
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите шприцы на лед во время процедуры подготовки.
- Подсоедините два стеклянных шприца со стопорным наконечником Люэра объемом 10 мл к коротким рычагам 3-ходового запорного крана и закройте третье выходное отверстие длинным рычагом.
- Убедитесь, что соединения надежны и герметичны: добавьте примерно 4 мл стерильного PBS в открытый шприц, удерживая поршень 2. Вставьте поршень 1 и толкайте оба поршня вперед и назад, проверяя герметичность. Если утечки не происходит, выбросьте PBS и снова снимите поршень 1.
- Пипетку 1 мл неполного адъюванта Фрейнда (ИФА) и 50 мкг рекомбинантного гликопротеина миелина олигодендроцитов (rMOG1-125) вместе и отрегулируйте смесь до конечного объема 2 мл со стерильным PBS (pH 7,4) в подходящей пробирке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за потерь эмульсии на кончиках или стенках шприцев во время приготовления приготовьте больший объем, чем предназначен для введения. Точно так же практичнее готовить более чем 1 животное одновременно.
- Разведенную смесь ИФА и рМОГ1-125 поместите в открытый шприц. Осторожно вставьте поршень, сохраняя слабое давление на противоположный поршень (Рисунок 3A).
- Эмульгируйте инокулюм, перемещая его от одного шприца к другому, толкая поршни вперед и назад до тех пор, пока он не станет белым и вязким (Рисунок 3B).
- Закрепите шприц с замком Люэра объемом 1 мл на открытом коротком рычаге 3-ходового запорного крана и заполните его инокулюмом (рис. 3C). Распределите весь инокулюм по 1 мл шприцев. Держите его на льду до момента укола. Вводите смесь в день приготовления.
7. Иммунизация
- Анестезируйте крысу изофлураном в камере (~2 мин, смешанный с кислородом 2 л/мин), а затем выдержите анестезию через маску (смешанную с кислородом 1,5 л/мин).
- Введите 200 μл инокулюма подкожно у основания хвоста с помощью иглы 21 G.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вводите инъекцию медленно, так как раствор вязкий.
8. Внутримозговая инъекция цитокинов
- Отрегулируйте длину соединительной канюли (2 мм). (Шаги подготовки см. на рисунке 4.)
- Наполните шприц 1 мл смесью цитокинов (500 нг/мкл фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-альфа), 300 ЕД/мкл рекомбинантного интерферона-гамма крысы (ИФН-гамма) в стерильном ПБС). Подсоедините шприц к соединительной канюле. Заполните канюлю цитокиновой смесью. Избегайте образования пузырей.
- Установите шприц на программируемый шприцевой насос и запрограммируйте его на впрыскивание 0,2 μл/мин (Рисунок 5A). Запустите насос и поддерживайте его в рабочем состоянии, чтобы избежать образования пузырьков воздуха на кончике канюли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость инъекции должна учитывать внутренний диаметр конкретного используемого шприца; Таким образом, диаметр шприца должен быть зарегистрирован во время настройки насоса.
- Обезболите крысу изофлураном в камере (~2 мин, смешанные с 2 л/мин кислорода), а затем выдержите анестезию через маску (смешанную с 1,5 л/мин кислорода) (Рисунки 5B и 5C). Нанесите смазывающие глазные капли, так как животное будет находиться под наркозом не менее 30 минут.
- Снимите колпачок катетера с впускным отверстием. Вставьте соединительную канюлю в катетер, закрутите и затяните ее (рисунки 5D и 5E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не затягивайте его слишком сильно, так как это разрушит верхний кончик катетера.
- Дайте инъекции продолжаться в течение 10 минут (общий объем инъекции составляет 2 мкл). Остановите насос. Оставьте канюлю внутри катетера на 20 минут, чтобы введенный объем полностью диффундировал.
- Открутите соединительную канюлю и медленно снимите ее, чтобы избежать эффекта вакуума.
- Снова прикрепите колпачок катетера к входному отверстию и закрутите его. Дайте животному восстановиться после анестезии в клетке.
