Создание модели раненой кожи овцы ex vivo, инфицированной бактериальным патогеном

Аннотация

Источник: Regan, H. C., et al. A Novel High-Throughput Ex vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics. J. Vis. Exp. (2022).

Видео демонстрирует создание модели кожи овцы ex vivo, зараженной золотистым стафилококком. Это включает в себя обработку биопсии кожи лба ягненка антибиотиками, создание раневого ложа, размещение его на проницаемой мембране в многолуночной пластине со средой, не содержащей антибиотиков, и установление бактериальной инфекции в кожной ране.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Стерилизация

1. Продезинфицируйте щипцы перед сбором головок, взяв чистые щипцы и проведя стерилизацию сухим жаром в духовке при 200 °C в течение 1 ч. Автоклавируйте всю стеклянную посуду при 121 °C в течение 15 мин перед использованием.
2. Выполняйте все описанные работы в кабинете по микробиологии 2 класса. Приготовьте все реагенты в соответствии с инструкциями производителя.

2. Сбор образцов

1. На скотобойне ягнята Суэйлдейла были забиты путем оглушения с помощью электричества или пистолета с невыпадающим затвором и обескровлены. Собирают бараньи головы не более чем через 4 ч после убоя.

3. Подготовка кочанов

1. Продезинфицируйте лобную часть ягненка, вылив примерно 100 мл раствора диоксида хлора с концентрацией 200 ppm на область пробы. Побрейте лобную часть головы с помощью электрических машинок для стрижки и промойте область 200 мл раствора диоксида хлора с концентрацией 200 ppm.
2. Протрите участок этанолом и синим валиком и покройте образец кремом для удаления волос в течение 35 мин. Аккуратно соскребите крем для удаления волос с помощью скребка и оцените образец участка. Если осталось значительное количество волос, повторите процесс эпиляции.
3. Используйте еще 200 мл раствора диоксида хлора для промывки участка, а затем промойте этанолом и протрите синим рулоном.
4. С помощью стерильного биопсийного перфоратора диаметром 8 мм вырезают образцы кожи диаметром 8 мм из подготовленной области. Удалите образцы с помощью стерильных щипцов и скальпеля с 15 лезвиями, следя за тем, чтобы весь кожный жир был удален.
5. Поместите образцы в стерильную банку объемом 0,5 л, наполненную стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS), а затем переложите их в стерильные пробирки объемом 50 мл с 50 мл раствора диоксида хлора 200 ppm, дважды переверните и оставьте для стерилизации на 30 минут.
6. Извлеките образцы из раствора диоксида хлора и промойте их, поместив в пробирку объемом 50 мл, заполненную 40 мл стерильного PBS. После промывки поместите каждый отдельный образец кожи в отдельную лунку 24-луночного планшета.
7. Добавьте 350 мкл предварительно нагретой среды, сохраняя образец на границе раздела воздух-жидкость. Состав сред следующий: среда МК (Medium 199 с солями Хэнкса, L-глутаматом и 1,75 мг/мл бикарбоната натрия) и Ham's F12 в соотношении 1:1, с добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS, 10% v/v), эпидермального фактора роста (EGF, 10 нг/мл), инсулина (5 мкг/мл), пенициллин-стрептомицина (100 ЕД/мл), и амфотерицин В (2,5 мкг/мл).
8. Запечатайте 24-луночные планшеты газопроницаемым уплотнением и инкубируйте при температуре 37 °C в влажном тканевом инкубаторе с 5% содержанием_CO2 в течение 24 часов.

4. Хранение образцов кожи

1. После инкубации удалите питательную среду и промойте образцы в 500 мкл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS). Добавьте в каждый образец среду, не содержащую антибиотиков, и инкубируйте при температуре 37 °C в увлажненном тканевом инкубаторе с 5% содержанием_CO2 в течение 24 часов для удаления остаточных антибиотиков в образце.
2. Если через 24 ч в среде, не содержащей антибиотиков, развивается мутность или грибковая инфекция, образец следует выбросить.

5. Приготовление инокулюма

1. Приготовьте пробирку объемом 50 мл с 10 мл стерильного триптического соевого бульона. Возьмите свежую агаровую пластину S. aureus и с помощью тампона переведите несколько колоний в бульон. Инкубировать в течение 18 ч при 37 °C при 150 об/мин.
2. Центрифугируйте при 4000 x g в течение 3 мин. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл стерильного PBS. Повторите дважды, чтобы обеспечить достаточное промывание ячеек.
3. Отрегулируйте инокулюм до 0,6 OD₆₀₀ в стерильном PBS. Подтвердите загрузку инокулята, проведя ручной подсчет жизнеспособных пластин.

6. Заражение образцов кожи

1. Приготовьте свежий 24-луночный планшет с 400 мкл предварительно подогретой среды без антибиотиков и добавьте 24-луночные вкладыши с помощью стерильных щипцов.
2. Удалите среду из образцов кожи, промойте 500 мкл стерильного PBS и удалите смывку. С помощью стерильных щипцов аккуратно удерживайте образец на дне лунки.
3. С помощью пункционной биопсии диаметром 4 мм сделайте центральный раневой лоскут, прокалывающий его на грубую глубину 1-2 мм. Затем с помощью скальпеля с 15 лезвиями и стерильных зубчатых щипцов для удаления верхнего слоя раневого лоскута. Вариабельность размеров раны может влиять на исход инфекции и конечные колониеобразующие единицы (КОЕ).
4. После того, как все образцы будут ранены, перенесите их в 24-луночные вкладыши с помощью стерильных щипцов. Пипеткой внесите 15 μл бактериального инокулюма в раневое ложе. Затем инкубируйте в течение 24 ч при 37 °C в увлажненном тканевом инкубаторе с 5% содержанием_CO2.
5. Если необходимы более длительные периоды инкубации, удаляйте среду и заменяйте ее свежей средой каждые 24 ч и инкубируйте в тех же условиях.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
24-луночная пластина-компаньон	Технология SLS	353504
Биопсийный пуансон 4 мм	Уильямс Медикал	Д7484
Центрифужные пробирки 50 мл	Научный центр Фишера	10788561
8 мм Biopsy Punch	Уильямс Медикал	Д7488
Раствор амфотерицина В, стерильный	сигма	А2942
Беспроводная машинка для стрижки волос Color Pro Style	Валь	9639-2117Х	Машинки для стрижки волос
Инкубатор с двумя духовками	Технология SLS	ОВе1020	Стерилизационная печь
Эпидермальный фактор роста	Технология SLS	Э5036-200УГ
этанол	Ханивелл	458600-2,5 л
ВЕТЧИНА F12	сигма	Н4888
Фетальная бычья сыворотка	Лабтех Интернэшнл	СА-115/500
щипцы	Научный центр Фишера	15307805
Крем для эпиляции	Вет	Не применимо
Heracell VIOS 160i	Термо Сайентиал	15373212	Инкубатор для тканевых культур
Heraeus Megafuge 16R	ВВР	521-2242	центрифуга
Вставка Individual 24 лунки 0,4 мкм мембрана	VWR Интернэшнл	353095
Инсулин рекомбинантный человеческий	Технология SLS	91077С-1Г
Medium 199 (МК медиа)	сигма	М0393
Микропланшет, клеточная культура Costar 96 лунка	Научный центр Фишера	10687551
Мультитрон	Инфорс	Не применимо	Бактериальный инкубатор
Таблетки PBS	сигма	П4417-100ТАБ
Пенициллин-стрептомицин	Технология SLS	П0781
Пластинчатые уплотнители	Научный центр Фишера	ЭСИ-Б-100
Сейф 2020	Научный центр Фишера	1284804	Микробиологический шкаф безопасности класса II
Лезвие скальпеля No15	Научный центр Фишера	О305
Скальпель Swann Morton	Научный центр Фишера	11849002
Бикарбонат натрия	сигма	С5761-1КГ
Зубчатые щипцы Allis Tissue	Росиаль	RSPU500-322
Триптический соевый бульон	Мерк Лайф Сайенс Великобритания Лимитед	41298-500Г-Ф
Таблетки Vimoba	Лаборатория Quip	VMTAB75BX

гг.