Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Очистка и экспансия NK-клеток человека
- Выделите мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) из Buffy Coat.
- Слой 35 мл образца охристого пальто на 15 мл Ficoll-Paque.
- Центрифугируйте при давлении 400 x g в течение 20 минут без тормоза и соберите PBMC с интерфейса.
- Извлеченные PBMC промывайте три раза, добавляя не менее равного объема PBS, центрифугируя при 400 x g в течение 5 минут и отсасывая промывку PBC. NK-клетка может быть выделена на этом этапе с помощью розеток.
- Расширяйте NK-клетки путем стимуляции облученными 10 x 10 6mbIL21-экспрессирующими фидерными клетками в 0, 7 и 14 дни. Замените среду свежей RPMI, содержащей 10% FBS, 1% глутамина, 1% пенициллина стрептомицина и 100 МЕ/мл IL-2 для всего объема среды через день.
2. Дизайн и выбор гРНК
- Выберите конкретные геномные локусы для таргетинга, используя онлайн-инструменты, например, NCBI, Ensemble.
пример.
Описание: Трансформирующий фактор роста бета-рецептор 2 (TGFBRR2) эктодомен
Посмотреть запись: PF08917
Вид InterPro: IPR015013< чел. />
Позиция: 49 - 157 aa
Целевая последовательность: экзон 4 гена TGFBR2 (ENSG00000163513)
- Чтобы спроектировать гРНК, используйте веб-инструменты для проектирования CRISPR, такие как http://crispr.mit.edu и «Benchling».
- Введите последовательность ДНК, выбранную на шаге 2.1. Выберите человеческий (hg 19) в качестве целевого генома. Проводники CRISPR (20 нуклеотидов, за которыми следует последовательность протоспейсерного соседнего мотива (PAM): NGG) будут сканироваться из последовательности, введенной ранее. Он также показывает возможные нецелевые совпадения по всему выбранному геному.
- Выберите три лучшие гРНК с наивысшим баллом, основываясь на их целевых и нецелевых показателях. Например, в таблице 1 показаны спроектированные РНК CRISPR для мишени на экзон 4 гена TGFBR2, предложенные веб-инструментами проектирования CRISPR.
- Упорядочьте CRISPR РНК как синтетические последовательно-специфичные крРНК.
- Закажите консервативную, трансактивирующую РНК (тракрРНК) для взаимодействия с крРНК посредством частичной гомологии.
3. Праймеры для скрининга удаления дизайна
- Праймеры дизайна, охватывающие сайты расщепления гРНК для анализа мутации T7E1.
- Используйте праймеры на расстоянии не менее 100.о. от прогнозируемого сайта расщепления, чтобы гарантировать, что небольшие инсерции-делеции (инделы) в целевом сайте sgRNA появятся на 1,5% агарозном геле после анализа мутаций. В таблице 2 представлены праймеры, которые используются для амплификации эктодомена TGFBR2.
4. Трансдукция первичных и расширенных NK-клеток человека
Примечание: Трансдукция элементов Cas9/RNP в NK осуществляется путем электропорации с использованием 4D-системы следующим образом.
- Подготовка клеток
- Для первичных NK-клеток инкубировать свежевыделенные NK-клетки в среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI) в присутствии 100 МЕ/мл IL-2 в течение 4 дней и провести электропорацию на 5-й день. Заменяйте носитель через день, как описано выше, и за день до трансдукции.
- Для расширенных NK-клеток стимулируйте клетки в 0-й день с помощью облученных питающих клеток в соотношении 1:1 и проводите электропорацию на 5-й, 6-й или 7-й день. Заменяйте носитель через день, как описано выше, и за день до трансдукции.
- В день электропорации приготовьте колбу Т25, наполненную 8 мл свежего RPMI, содержащего 100 МЕ/мл IL-2, для клеток, подвергающихся электропорации, и предварительно инкубируйте колбы во увлажненном 37 °C и 5%CO2 инкубаторе><.
заметка: Размороженные клетки или клетки, подвергшиеся 2-й или 3-й стимуляции, могут быть подвергнуты электропорации в любое время после их восстановления, как описано.
- Возьмите 3 - 4 × 106 клеток в одно состояние для получения 26 мкл трансдукционной смеси.
заметка: Очень высокая концентрация NK-клеток в растворе электропорации увеличивает скорость трансдукции.
- Промойте клетки 3 раза PBS, чтобы удалить весь FBS, который обычно содержит активность РНКазы. Каждый раз уменьшайте их при 300 x g в течение 8 минут.
заметка: Рассмотрим 7 условий электропорации для Cas/RNP в виде одиночной гРНК (гРНК1, гРНК2, гРНК3) и комбинации двух гРНК (гРНК1+гРНК2, гРНК1+гРНК3, гРНК2+гРНК3) и одного контроля без Cas9/RNPs.
- Образуют комплекс crRNA:tracerRNA/complex
- Ресуспендируйте крРНК (гРНК1, гРНК2 и гРНК3) и трассерРНК в 1x растворе TE до конечных концентраций 200 мкМ. Смешайте 2,2 мкл каждой 200 мкМ гРНК с 200 мкМ трассерРНК, как показано в таблице 3.
- Нагрейте образцы до 95 °C в течение 5 минут и дайте остыть на столе до комнатной температуры (15 - 25 °C). Храните ресуспендированные РНК и крРНК: tracrРНК/комплекс при температуре -20 °C для последующего использования.
- Сформировать комплекс РНП<бр />
Примечание: Для экономии времени формируйте комплекс РНП во время этапа промывки 4.1.5.
- Для дуплексной реакции одиночная crRNA:tracrRNA разбавляют эндонуклеазу Cas9 до 36 мкМ, как показано в примере в таблице 4.
- Для комбинированной трансдукции дуплексов crRNA:tracrRNA разбавляют эндонуклеазу Cas9 до 36 мкМ, как показано в примере в таблице 5.
- Добавляйте эндонуклеазу Cas9 к дуплексам crRNA:tracrРНК медленно, вращая кончик пипетки, в течение от 30 с до 1 минуты.
- Выдержать смесь при комнатной температуре в течение 15 - 20 минут. Если смесь не готова к использованию после инкубации, держите смесь на льду до использования.
- Электропорация
- Добавьте всю добавку в раствор для электропорации Р3 и держите его при комнатной температуре.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу (3 - 4 × 106 ячеек из стадии 4.1.5) в 20 мкл первичного 4D раствора для электропорации P3. Избегайте образования пузырьков воздуха при пипетировании.
Примечание: Клетки не следует оставлять на длительное время в растворе Р3.
- Немедленно добавьте 5 μL комплекса RNP (Шаг 4.3) в клеточную суспензию.
- Добавьте 1 мкл 100 мкМ усилителя электропорации Cas9 в смесь Cas9/RNPs/клетки.
- Перенесите смесь Cas9/RNPs/ячеек в электропорационные полоски объемом 20 μL.
- Аккуратно постучите по полоскам, чтобы убедиться, что образец покрывает нижнюю часть полосок.
- Запустите систему 4D электропорации и выберите программу EN-138.
Таблица 1. Три сконструировали гРНК для нацеливания на экзон 4 эктодомена TGFBR2 в виде синтетической кРНК.
| ГРНК NO. | Последовательность гРНК | Заказывается как синтетическая crRNA |
| гРНК1 | 5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3 | /AltR1/rArGrUrCrArUrGrCrUrUrGrUrUrUrUrUrUrUrGrCrU/AltR2/ |
| гРНК2 | 5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3 | /AltR1/rArUrUrUrGrCrCrCrCrR |
| гРНК3 | 5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3 | /AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrUrUrA rGrArG rCrCrUrA rUrGrCrU/AltR2/ |
Таблица 2. Праймеры, используемые для амплификации гена эктодомена TGFBR2
| TGFBR 2 эктодомен Праймеры FWD | 5 GTC TGC TCC AGG TGA TGA TTA T3 |
| TGFBR2 эктодомен Праймер REV | 5 GGG CCT GAG AAT CTG CAT TTA 3 |
Таблица 3. Формирование комплекса crRNA:tracrRNA/с использованием 200 мкМ РНК
См.
См.
См.
| компонент | Количество (мкл) |
| 200 мкМ кРНК | 2.2 |
| 200 мкМ трассерная РНК | 2.2 |
| Буфер IDTE | 5.6 |
| Конечный продукт | 10 |
Таблица 4. Для дуплексной реакции одиночная crRNA:tracrRNA разбавляют эндонуклеазу Cas9 до 36 мкМ.
| компонент | Количество (μл) |
| ПБС | 1 |
| crRNA:дуплекс tracrRNA (из шага 4.2) | 2 (200 пмоль) |
| Эндонуклеаза Alt-R Cas9 (сток 61 мкМ) | 2 |
| Общий объем | 5 мкл |
Таблица 5. Для комбинированной трансдукции дуплексов crRNA:tracrRNA разбавляют эндонуклеазу Cas9 до 36 мкМ.
| компонент | Количество (μл) |
| ПБС | 1 |
| crRNA:дуплекс tracrRNA (ex. gRNA1) | 1 (100 пмоль) |
| crRNA:дуплекс tracrRNA (ex. gRNA2) | 1 (100 пмоль) |
| Эндонуклеаза Alt-R Cas9 | 2 |
| Общий объем | 5 μл |
