$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Генерация рекомбинантных живых аттенуированных вакцин против гриппа методом обратной генетики
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный протокол генерации рекомбинантных вирусов гриппа методом обратной генетики был описан в предыдущих исследованиях и выходит за рамки этого отчета. Вкратце, спасение вакцин против гриппа, адаптированных к холоду, осуществляется в шкафу класса биобезопасности II в соответствии с уровнем биобезопасности 2 (BSL2) и включает в себя шаги, описанные ниже.
- Создать реассортантную вакцину против гриппа, адаптированную к холоду, используя в качестве фона адаптированный к холоду штамм A/Ann Arbor/6/60 (H2N2), а также гемагглютинин (HA) и модифицированную нейраминидазу (NA) штамма A/PR/8/34 (H1N1) (рисунок 1A). Модификация гена NA заключается в замене консервативной последовательности в белковом стебле (остатки с 65 по 72) на основе ПЦР на короткую последовательность кДНК, кодирующую полученный из куриного овальбумина (OVA) пептид SIINFEKL (рис. 1B). Пептид SIINFEKL является высокоиммунодоминантным пептидом в контексте H-2b MHC класса I, ограниченного ответом мышей C57BL/6.
- Планшет 106 293Т-клеток на лунку в 6-луночных планшетах с использованием 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) DMEM с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина (P/E).
- Приготовьте смесь для трансфекции плазмид: добавьте по 1 г каждой из плазмид, кодирующих кДНК для PB2, PB1, PA, NP, M, NS из штамма гриппа A/Ann Arbor/6/60 и по 1 г плазмид, кодирующих NA-SIINFEKL и HA из гриппа A/PR/8/34. Добавьте предварительно подогретую среду Opti - минимальную основную среду (Opti-MEM) (15 мкл для конечного объема 100 мкл/лунку).
- Инкубировать трансфекционную смесь в течение 30 мин при РТ.
- Добавьте 100 μл смеси для трансфекции/лунки и инкубируйте в течение 16 часов при 37 °C и 5% CO2.
- Смените питательную среду ячейки с помощью DMEM 0,3% BSA, 1% P/E при 33 °C и 5% CO2 в течение 5 часов.
- Добавьте 106 разрешающих гриппозных клеток собачьих почек Мадина-Дарби (MDCK) в диметилсульфоксид (ДМСО), содержащий 1 мкг/мл трипсина из поджелудочной железы крупного рогатого скота, обработанной L-1-тосиламидом-2-фенилэтилхлорметилкетоном (TPCK-трипсин). Сокультуры 293T-MDCK выдерживают в течение 2–3 дней при температуре 33 °C и 5%CO2.
- Соберите надосадочную жидкость из кокультур клеток MDCK-293T и очистите центрифугированием при 260 x g в течение 5 минут.
