Получение рекомбинантных живых аттенуированных вирусов гриппа для вакцин

Аннотация

Источник: Pérez-Girón, J. V. et al, Интраназальное введение рекомбинантных вакцин против гриппа на химерных моделях мышей для изучения иммунитета слизистой оболочки.J. Vis. Exp. (2015)

В видео демонстрируется метод создания адаптированных к холоду рекомбинантных вирусов гриппа. Он включает в себя трансфекцию клеток человека двунаправленными плазмидами с последующей инкубацией при более низкой температуре для получения вирусов, пригодных для производства вакцин, характеризующихся сниженной репликацией в более теплых условиях.

Протокол

1. Генерация рекомбинантных живых аттенуированных вакцин против гриппа методом обратной генетики

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный протокол генерации рекомбинантных вирусов гриппа методом обратной генетики был описан в предыдущих исследованиях и выходит за рамки этого отчета. Вкратце, спасение вакцин против гриппа, адаптированных к холоду, осуществляется в шкафу класса биобезопасности II в соответствии с уровнем биобезопасности 2 (BSL2) и включает в себя шаги, описанные ниже.

1. Создать реассортантную вакцину против гриппа, адаптированную к холоду, используя в качестве фона адаптированный к холоду штамм A/Ann Arbor/6/60 (H2N2), а также гемагглютинин (HA) и модифицированную нейраминидазу (NA) штамма A/PR/8/34 (H1N1) (рисунок 1A). Модификация гена NA заключается в замене консервативной последовательности в белковом стебле (остатки с 65 по 72) на основе ПЦР на короткую последовательность кДНК, кодирующую полученный из куриного овальбумина (OVA) пептид SIINFEKL (рис. 1B). Пептид SIINFEKL является высокоиммунодоминантным пептидом в контексте H-2b MHC класса I, ограниченного ответом мышей C57BL/6.
2. Планшет 10⁶ 293Т-клеток на лунку в 6-луночных планшетах с использованием 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) DMEM с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина (P/E).
3. Приготовьте смесь для трансфекции плазмид: добавьте по 1 г каждой из плазмид, кодирующих кДНК для PB2, PB1, PA, NP, M, NS из штамма гриппа A/Ann Arbor/6/60 и по 1 г плазмид, кодирующих NA-SIINFEKL и HA из гриппа A/PR/8/34. Добавьте предварительно подогретую среду Opti - минимальную основную среду (Opti-MEM) (15 мкл для конечного объема 100 мкл/лунку).
4. Инкубировать трансфекционную смесь в течение 30 мин при РТ.
5. Добавьте 100 μл смеси для трансфекции/лунки и инкубируйте в течение 16 часов при 37 °C и 5% CO₂.
6. Смените питательную среду ячейки с помощью DMEM 0,3% BSA, 1% P/E при 33 °C и 5% CO₂ в течение 5 часов.
7. Добавьте 10⁶ разрешающих гриппозных клеток собачьих почек Мадина-Дарби (MDCK) в диметилсульфоксид (ДМСО), содержащий 1 мкг/мл трипсина из поджелудочной железы крупного рогатого скота, обработанной L-1-тосиламидом-2-фенилэтилхлорметилкетоном (TPCK-трипсин). Сокультуры 293T-MDCK выдерживают в течение 2–3 дней при температуре 33 °C и 5%_CO2.
8. Соберите надосадочную жидкость из кокультур клеток MDCK-293T и очистите центрифугированием при 260 x g в течение 5 минут.

Результаты

Рисунок 1. Проектирование прослеживаемых LAIV.(А) Сегменты гриппа, клонированные в амбисенс-плазмидах, трансфицировали в клетки 293Т с использованием липофектамина 2000. Через 24 ч после трансфекции надосадочную жидкость, полученную из 293Т-клеток, использовали для покрытия гриппоз-разрешающих клеток собачьих почек Мадина-Дарби (MDCK) в присутствии 1% трипсина TPCK. Весь протокол про...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Модифицированная среда Eagle от Dulbecco (DMEM 1X)	Технологии Gibco RL-Life	41965-039
Opti MEM	Технологии Gibco RL-Life	31985-047 (Английский)
Липофектамин 2000	Технологии Invitrogen-Life	11668-027 (Английский)
Пенициллин-стрептомицин (10.000 ЕД/мл)	ПАА	П11-010
Бычий сывороточный альбумин	Сигма-Олдрич	А2153
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Сигма-Олдрич	Д2650
Трипсин-ТПК	Сигма-Олдрич	Т1426