Трехмерная кокультуральная модель инфильтрации Т-клеток в опухолевых сфероидах

Аннотация

Источник: Lin, Y., et al. Мониторинг инвазии раковых клеток и цитотоксичности Т-клеток в 3D-культуре. J. Vis. Exp. (2020).

Это видео демонстрирует метод создания трехмерного сфероида опухоли и совместной культуры Т-клеток. Готовится агарозный слепок с микролунками, содержащими опухолевые сфероиды, с последующим добавлением Т-клеток. После инкубации такая установка позволяет изучать взаимодействие Т-клеток с опухолевыми сфероидами в контролируемой трехмерной среде.

Протокол

1. Генерация сфероидов

1. Приготовьте и автоклавируйте 2%-ную агарозу в 1x фосфатно-солевой буфер (PBS) (например, 1 г агарозы в 50 мл 1x PBS) и автоклавные резиновые формы на 35 и 81 микролунки.
   осторожность: Избегайте использования легкоплавкой агарозы для получения агарозных отливок для иммуногистохимической обработки (ИГХ).
2. Готовим агарозные слепки
   ПРИМЕЧАНИЕ: 35-луночные слепки используются для анализов инвазии, иммунофлуоресценции (ИФ) и выделения клеток. Слепки на 81 микролунку используются для анализа цитотоксичности, ИГХ, выделения клеток и экстракции рибонуклеиновых кислот (РНК).
   1. После того как агароза будет автоклавирована, дайте расплавленной агарозе остыть примерно до 60–70 °C. В колпаке для клеточных культур используйте асептический метод и пипетируйте 500 мкл расплавленной агарозы в резиновую форму на 81 микролунку на лунку или 330 мкл в резиновую форму на 35 микролунок на лунку><. осторожность: Избегайте образования пузырьков при смешивании или пипетировании агарозы. Удалите пузырьки с помощью аккуратного пипетирования.
   2. После того как агароза застынет, осторожно согните резиновую форму, чтобы снять с нее агарозный слепок. Таким образом, поместите руки над соответствующей пластиной лунника и дайте агарозному отливу упасть прямо в одну из лунок луночной пластины.
      заметка: Сгибайте резиновую форму в разных положениях, чтобы избежать чрезмерного изгиба. Может быть полезно согнуть резиновую форму и одновременно осторожно надавить снизу.
   3. Чтобы уравновесить агарозные слепки, добавьте среду для клеточных культур, состоящую из модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (2,5 мл/лунка для 12-луночного планшета и 1 мл/лунку для 24-луночного планшета). Поместите лунку в инкубатор для клеточных культур (37 °C, 5%_CO2) и инкубируйте в течение 1 часа.
3. Тем временем подготовьте культуру клеток к посеву.
   заметка: Общее число посева клеток на слепок агарозы должно быть определено исследователем. Для линий клеток первичного рака поджелудочной железы у мышей 35 000 клеток/35-микролуночный слепок и 81 000 клеток/81-микролуночный слепок (в среднем 1000 клеток/сфероидов) засевают для всех последующих анализов. Средний диаметр сфероида через 48 ч составляет около 150\u2012200 мкм.
4. Сначала удалите питательную среду вокруг агарозного слепка с помощью пипетки P1000, наклонив луночный планшет. Затем аккуратно уберите среду в посевную камеру.
5. Приготовленную суспензию опухолевых клеток осторожно высевать по каплям в камеру для посева клеток. Осторожно поместите лунку обратно в инкубатор для клеточных культур (37 °C, 5%_CO2) на 15 мин.<бр/> заметка: Во время этого шага ячейки осядут в микролунки агарозного литья.
6. Добавьте дополнительную среду снаружи агарозной отливки (2,5 мл/лунка для 12-луночного планшета и 1 мл/лунку для 24-луночного планшета).
7. Поместите лунку обратно в инкубатор для клеточных культур (37 °C, 5%_CO2) на 48 ч.<бр/> заметка: Обычно требуется до нескольких часов, чтобы клетки образовали сфероиды в микролунках. Как правило, сфероиды солидных опухолевых клеток образуются через 24 ч и стабильны через 48 ч. Однако это может варьироваться в зависимости от разных клеточных линий. При необходимости смените среду для культивирования клеток, осторожно наклонив луночный планшет с агарозными слепками и удалив окружающую среду для клеточных культур с помощью пипетки P1000. Затем аккуратно добавьте свежую среду, проведя ее пипеткой по стенке лунки. Обычно нет необходимости менять среду внутри слепков из-за ее небольшого объема и риска удаления сфероидов.

2. Ко-культура с Т-клетками

1. Ресуспендируйте необходимое количество Т-клеток в 75 мкл (литье на 35 микролунок) или в 190 мкл (литье на 81 микролунку) соответствующей среды для культивирования Т-клеток (RPMI с добавлением 10% сыворотки плода крупного рогатого скота и 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина).
2. Сначала удалите питательную среду для клеток вокруг агарозного слепка с помощью пипетки P1000, наклонив луночный планшет. Затем медленно и осторожно удалите среду из отливки, осторожно нацеливаясь на один угол посевной камеры с помощью пипетки P200, удерживая пластину лунки под наклоном другой рукой.
3. (Критический шаг 1) Поскольку существует риск удаления сфероидов, контролируйте потерю сфероидов путем сравнения количества сфероидов в микролунках до и после удаления среды путем просмотра под микроскопом при 10-кратном увеличении.
4. Осторожно засейте суспензию Т-клеток по каплям в посевную камеру агарозного отлива, держа пипетку Р200 примерно на 0,5 см над отливкой.
5. (Критический шаг 2) Существует риск вымывания сфероидов при добавлении Т-клеток. Поэтому крайне важно добавлять Т-клетки очень медленно и примерно на 0,5 см выше посевной камеры.
   заметка: Одна из возможностей уменьшить количество вымытых сфероидов заключается в том, чтобы направить пипетку на один угол посевной камеры при добавлении Т-клеток, таким образом, риск вымывания сфероидов в этом углу может быть только вышедшим
.
6. Осторожно поместите лунку обратно в инкубатор для клеточных культур (37 °C, 5%_CO2) на 15 минут.
7. Выньте планшет из инкубатора и добавьте свежую среду для культивирования клеток (среда Мемориального института Розуэлл Парк (RPMI) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 100 единиц/мл пенициллина/стрептомицина) вокруг агарозного литца, медленно дозируя его вдоль стенки лунки.
8. Поместите лунку-планшет обратно в инкубатор для клеточных культур на 48 часов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
3D чашки Петри	Микроткани Инк	Z764019 и Z764051	В протоколах они обозначаются как «резиновые формы»; 81-микролуночные и 35-микролуночные формы
8-луночные камерные слайды	Лаб-Тек	154534
Агарозный тип I, низкий EEO	Сигма-Олдрич	А6013
DMEM, фетальная бычья сыворотка	ТермоФишер	11965092, 16000044	в протоколах именуется «средой для культивирования клеток»
РПМИ	ТермоФишер	11875093	для среды для культивирования Т-клеток