Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Процедура накопления
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное количество ДНК и площадь целевой поверхности кожи могут варьироваться для разных генов и нуждаются в дальнейшей оптимизации. Сила укола и количество раз, необходимое для ослабления рогового слоя кожи, также могут варьироваться в зависимости от толщины кожи. Эти условия должны быть тщательно определены после оценки уровня экспрессии акфуфицированных транскриптов генов с помощью qRT-PCR.
- Взвесьте мышей и введите трибромэтанол (400 мкг на г массы тела) путем перитонеальной инъекции.
Примечание: 2,2,2-трибромэтанол является инъекционным анестетиком, который обычно использовался у мышей. Растворы получают путем растворения нефармацевтического трибромэтанола (2,5 г) в дистиллированной воде (200 мл), содержащей 2,5% 2-метил-2-бутанола.
- Используйте ветеринарную офтальмологическую мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
заметка: Обезболивающий эффект будет вызван через 1 - 2 минуты. Перед операцией проверьте рефлекс защемления пальца ноги, чтобы убедиться в достаточной глубине анестезии.
- Побрейте кожу тыльной стороны и нанесите крем для депиляции, чтобы растворить белки кератина в стержне волоса.
заметка: Использование крема для депиляции для удаления волос будет способствовать вливанию ДНК в кожу.
- Используйте смоченные в воде ватные тампоны, чтобы стереть крем для депиляции.
заметка: Крем для депиляции растворяется в воде. Полное удаление крема предотвратит образование жирной поверхности и обеспечит лучший результат прокалывания.
- Используйте стерильный ватный тампон, смоченный в 70% этаноле, для дезинфекции поверхности кожи.
- Отметьте целевую зону (1 см х 1 см) на депилируемой коже с помощью предварительно отмеренного трафарета. заметка: Разметка целевого участка поможет приложить пучок игл вверх-вниз в пределах определенной области. Это важно для обеспечения доставки одинакового количества ДНК на определенную площадь поверхности, чтобы свести к минимуму вариации от эксперимента к эксперименту.
- Капните каплю плазмидной ДНК объемом 10 мкл (10 мкг) на отмеченную кожу.
заметка: Количество ДНК для активации варьируется в зависимости от разных генов и типа вектора экспрессии. Количество используемой ДНК должно быть тщательно титровано перед проведением интересующего эксперимента. 10 μL - это небольшая капля жидкости, которая хорошо ложится на выбритую и депилированную кожу, не скатываясь вниз во время укола. Включите контрольную группу мышей, получавших 10 мкл пустой векторной ДНК, для сравнения с мышами, получавшими исследуемый ген.
- Удерживайте пучок акупунктурных игл (Рисунок 1B) и проколите отмеченную поверхность движениями вверх и вниз 100 раз или до тех пор, пока влага из ДНК из PBS на коже не исчезнет. заметка: Может возникнуть некоторое покраснение поверхности кожи. Избегайте глубоких надрезов, которые кровоточат.
Количество покалывающих движений вверх и вниз на поверхности кожи оперативно определяется, когда на коже исчезает влага из ДНК в PBS (10 μL). Мы принимали решение 100 раз за 30 секунд, потому что это дало наиболее стабильные результаты для генов, доставляемых аккуфекцией. Если применимо, иглы можно повторно использовать для нанесения до 6 уколов кожи мишени (1 см x 1 см каждый). Промойте иглы в 70% этаноле и PBS между накоплениями. Меняйте иглы, когда они тусклые, или на другую плазмидную ДНК, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
- Поместите окунувшихся мышей на грелку, чтобы поддерживать температуру тела до пробуждения.
- Верните мышей в клетку, когда они придут в сознание. заметка: Содержать окуфицированных мышей следует в отдельной клетке (менее 5 животных в клетке) от клетки с незараженными мышами.
- Поставьте бутылку с водой на место и верните клетку на стойку IVC (индивидуально вентилируемая клетка).
2. Послеоперационный уход
- В течение первых 48 часов после процедуры внимательно наблюдайте за мышами на предмет любого дискомфорта, включая изменения в поведении (беспокойство, возбуждение или расстройство пищевого поведения) или ненормальный внешний вид (грубая шерсть или сгорбленная осанка).
