Анализ in vitro для оценки противоопухолевой активности опухолеспецифичных CAR-Т-клеток

Аннотация

Источник: Kueberuwa, G., et al. Сингенная модель В-клеточной лимфомы мыши для доклинической оценки CD19 CAR T-клеток. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует анализ in vitro для проверки активности химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток. Клетки В-клеточной лимфомы, экспрессирующие антиген CD19 и цитоплазматическую люциферазу, культивируют совместно с CD19-специфичными CAR-Т-клетками. Связывание CAR с CD19 в опухоли заставляет CAR-T-клетки высвобождать цитокины и токсины, которые вызывают цитотоксичность опухолевых клеток. Активность CAR-Т-клеток оценивают путем количественного определения высвобождаемого цитокина и снижения люцифераз-опосредованной биолюминесценции в опухолевых клетках.

Протокол

1. Валидация активности CAR-Т-клеток in vitro

1. Затравка сингенных клеток-мишеней CD19+ опухолевых клеток с экспрессией люциферазы или без нее при плотности 1 x 10⁴ клетки в 100 мкл полной Т-клеточной среды (ТКМ)/лунки в 96-луночной U-образной тканевой культуральной тарелке.
2. Добавьте 1 x 10⁴ CD19 CAR T-клеток/лунку в объеме 100 μл/лунку, чтобы достичь соотношения эффектора к мишени (E:T) 1:1,
   заметка: Соотношения E:T должны быть установлены для каждой конструкции CAR и целевой клеточной линии.
3. Используйте только Т-клетки и только опухолевые клетки в качестве отрицательного контроля, а также Т-клетки, стимулируемые форбол-миристат-ацетатом (ФМА) (50 нг/мл) и иономицином (1 мкг/мл) в качестве положительного контроля для высвобождения интерферона-гамма (ИФНγ). Совместное культивирование клеток при 37 °C, 5%_CO2 в течение 16-24 ч.
4. После совместного культивирования центрифугируйте планшеты при давлении 500 x g в течение 5 мин и соберите надосадочную жидкость для дальнейшего анализа ИФНγ и IL-12p70 методом иммуноферментного анализа.
   заметка: Его можно хранить при температуре -80 °C.
5. Повторно суспендировать клеточные гранулы в 100 мкл PBS, содержащего люциферин (конечная концентрация 1,5 мг/мл). Инкубируйте пластины в течение 10 минут при 37 °C. Затем измерьте люминесценцию из каждой лунки с помощью подходящего люминометра><. заметка: Время воздействия должно быть оптимизировано в зависимости от клеточных линий и плотности. Репрезентативные результаты представлены на рисунке 1а. Цитотоксичность CAR-T-клеток ex-vivo может быть изменена для экспрессии люциферина путем совместного культивирования с клеточными линиями, экспрессирующими целевой антиген. Поскольку CAR-Т-клетки убивают клетки-мишени, люциферин высвобождается, поэтому снижение сигнала люминометрии коррелирует с гибелью клеток. Нетрансдуцированные клетки часто могут оказывать влияние на жизнеспособность клеток-мишеней, особенно в течение длительных инкубационных периодов. Измерьте концентрацию мышиного IFNγ и IL-12p70 в надосадочной жидкости в соответствии с протоколами ИФА производителя. Репрезентативные результаты представлены на рисунках 1b и 1c. Активация CAR-T-клеток ex-vivo путем совместного культивирования с клеточными линиями, экспрессирующими целевой антиген, может быть проанализирована путем анализа содержания надосадочной жидкости с помощью иммуноферментного анализа. Соотношение CAR-Т-клеток к клеткам-мишеням и продолжительность периода совместного культивирования должны быть оптимизированы для каждой конструкции CAR, клеточной линии-мишени и аналита. Лечение ПМА и иономицином может быть использовано в качестве положительного контроля для подтверждения качества Т-клеток и их способности к ответу.

Результаты

Рисунок 1. Валидация активности CAR T-клеток. CAR-Т-клетки αmCD19 культивировали совместно с клетками лимфомы A20, модифицированными для экспрессии люциферазы (1 x 10⁴:1 x^{10 4}) в течение 16 ч в 96-луночном планшете с U-образным дном. После совместного культивирования клетки гранулировали и собирали надосадочную жидкость. А) Клетки повторно суспендировали в PBS и...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
100X пенициллин-стрептомицин-глутамин (PSG)	Gibco	10378016
Проточный цитометр - LSR Fortessa x20	BD Biosciences	658222Р1
Сыворотка для плода крупного рогатого скота	Gibco	10270
IL-12 p70 Мышь без покрытия ELISA Kit	Инвитроген	88-7121-76
Иономицин кальциевая соль	Сигма- Олдрич	И0634
Люминометр - Lumistart Omega	BMG Labtech	415-301
Набор ИФА для мыши ИФН-γ	Диаклон	861.050.010 Материал 861.050.010
Форбол 12-миристат 13-ацетат (ПМА)	Сигма- Олдрич	П8139
RPMI 1640 Средний	Лонза	БЭ12-167Ф
XenoLight D-Люциферин	Перкин Элмер	122799

шт.