1. Анализ цитотоксичности: протокол анализа
- Используйте круглое дно, обработанное культурой 96-луночный планшет для установки планшета, как показано в таблице 1. В этой таблице представлены экспериментальные контрольные и 3 комплекта экспериментальных колонок НК. Это может быть расширено до 10 экспериментальных колонок NK в 96-луночной пластине.
- Центрифугируйте планшет для анализа при температуре 250 x g в течение 4 минут, чтобы убедиться в том, что эффектор и клетки-мишени находятся в контакте. Инкубируйте 96-луночный планшет в течение 5 часов в инкубаторе с увлажненной камерой при 37 °C, 5%CO2 для достижения достаточного контакта между клетками-мишенью и эффекторными клетками, а также лизиса клеток-мишеней эффекторными клетками.
заметка: Протокол можно поставить на паузу здесь.
- За 45 минут до сбора надосадочной жидкости добавьте 10 мкл 10-кратного раствора лизиса в лунки максимального высвобождения ЛДГ клетки-мишени (лунки 1E, 1F, 1G и 1H) и поместите планшет обратно в увлажненную камеру.
- По истечении времени инкубации центрифугируйте планшет при давлении 250 x g в течение 4 мин. С помощью многоканального пипеттора перенесите 50 μL аликвот из всех лунок на свежий 96-луночный планшет для плоскодонного анализа.
заметка: Не прикасайтесь ко дну лунок, чтобы клетки не переносились в свежую пробирную пластину. Не используйте обработанную культивированную пластину в качестве свежей пробирной пластины.
2. Сделайте реактив для анализа.
- После того, как буфер для анализа достигнет комнатной температуры, добавьте 12 мл буфера для анализа в одну бутылку смеси для субстрата. Переверните и аккуратно встряхните до полного растворения. 1 флакона достаточно для двух 96-луночных планшетов.<бр/>
заметка: Пробирный буфер следует беречь от света во время размораживания. Перемешайте непосредственно перед использованием.
- Добавьте 50 мкл реагента для анализа во все лунки в пробирной пластине, начиная с шага 4.6. Накройте тарелку фольгой, чтобы защитить ее от света, и выдерживайте 30 минут при комнатной температуре.
заметка: Вновь изготовленный реактив пробирного анализа следует хранить в морозильной камере. Реагент действителен примерно 8 недель.
- Добавьте 50 μL Stop Solution в каждую лунку. Считайте показания в течение 1 часа после добавления Stop Solution и запишите поглощение при 490 нм.<бр/>
Репрезентативные данные приведены в таблице 2.
Таблица 1: Схема пробирного планшета. TCS = спонтанное высвобождение ЛДГ клеток-мишеней (50 мкл клеток-мишеней + 50 мкл клеточной среды); TCM = максимальное высвобождение ЛДГ клеток-мишеней (50 мкл клеток-мишеней + 50 мкл среды клеток-мишеней); VCC = контроль коррекции объема (среда ячейки-мишени 50 μл + среда NK-ячейки 50 μл); CMB = контроль фона культуральной среды (50 мкл клеточной среды-мишени + 50 мкл среды NK-клеток); ECSR = спонтанное высвобождение эффекторных клеток (50 мкл NK-клеток + 50 мкл среды NK-клеток); EW = Экспериментальные лунки (50 мкл мишенных ячеек + 50 мкл NK-ячеек).
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| ТКС | ВЦК | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| ТКС | ВЦК | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| ТКС | ВЦК | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| ТКС | ВЦК | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| ТКМ | СМВ | РЭБ-1 | РЭБ-2 | РЭБ-3 |
| ТКМ | СМВ | РЭБ-1 | РЭБ-2 | РЭБ-3 |
| ТКМ | СМВ | РЭБ-1 | РЭБ-2 | РЭБ-3 |
| ТКМ | СМВ | РЭБ-1 | РЭБ-2 | РЭБ-3 |
Таблица 2: Исходные данные об абсорбции анализарной пластины, содержащей экспериментальные контрольные элементы в колонках 1 и 2 и экспериментальных лунках для измерения цитотоксичности плацентарных NK-клеток крыс NP и RUPP против клеток-мишеней YAC1.
Кабель
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| | нп | РУПП | нп |
| 0,615 | 0,484 | 0,473 | 0.463 | 0,471 |
| 0,586 | 0,484 | 0,458 | 0.474 | 0.469 |
| 0,61 | 0.486 | 0,464 | 0,459 | 0.469 |
| 0,605 | 0,55 | 0,524 | 0.526 | 0.543 |
| 0.576 | 0,504 | 0.519 | 0,502 0,528 | 00.528 |
| 0.565 | 0,512 | 0,515 | 0,513 | 0.531 |
| 0.563 | 0.581 | 0.526 | 0,508 | 0.519 |
