1. Синтез поликапролактонтриакрилата (PCLTA)
- Высушите 3,2 мл триола поликапролактона (PCL) 400 Да в течение ночи при 50 °C в открытой колбе с круглым дном объемом 200 мл и карбонат калия (K2CO3) в стеклянном флаконе при 90 °C.
- Смешайте триол с 6,4 мл дихлорметана (DCM) и 4,246 гК2СО3 под аргоном.
- Смешайте 2,72 мл акрилоилхлорида с 27,2 мл DCM и добавьте по каплям в реакционную смесь в колбе в течение 5 минут.
- Накройте реакционную смесь алюминиевой фольгой и оставьте ее в покое при комнатной температуре на 24 часа под аргоном.
- Через 24 ч отфильтруйте реакционную смесь с помощью фильтровальной бумаги на воронке Бюхнера под вакуумом, чтобы отбросить излишки реагентов.
- Преципитать фильтрат из стадии 1.5, который содержит полимер с торцевой крышкой в диэтиловом эфире в соотношении 1:3 (об./об.) и ротавап при 30 °С для удаления диэтилового эфира.
2. Образование полипузыря
ПРИМЕЧАНИЕ: Впрыскивание полимера в деионизированную (DI) воду приведет к тому, что полипузырьки мигрируют на дно флакона, что приведет к сплющенному дну. Используйте 10% (масс./об.) карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) для наполнения стеклянного флакона, чтобы избежать сплющивания полипузырьков.
- Приготовьте 10% (масс./об.) раствор КМЦ в деионизированной воде.
- Наполните стеклянный флакон объемом 0,92 мл 0,8 мл 10% CMC с помощью транспортной пипетки объемом 1 мл.
- Смешайте 1000 мг/мл 14 кДа PCL с DCM и синтезируйте PCLTA в соотношении 1:3 (объем/объем) в общем объеме 200 μл или получите 200 μл 1000 мг/мл диакрилата 5 кДа поли (молочно-ко-гликолевой кислоты) (PLGADA) в хлороформе.
- Смешайте 2-гидрокси-4'-(2-гидроксиэтокси)-2-метилпропиофенон (фотоинициатор) со смесью полимеров (PLGADA или PCL/PCLTA) в соотношении 0,005:1 (об./об.).
- Загрузите 200 мкл полимерной смеси в стеклянный шприц объемом 1 мл, установленный на шприцевом насосе, который соединен с дозирующей трубкой из нержавеющей стали с внутренним диаметром 0,016 дюйма.
- Используйте микромотор для управления движением полимерной трубки вперед и назад, чтобы ввести полимер в 10% CMC в стеклянном флаконе для образования полипузырька.
- Отверждайте полипузырьки под воздействием ультрафиолета (УФ) на длине волны 254 нм в течение 60 с при 2 Вт/см2.
- Мгновенная заморозка полипузырьков в жидком азоте и лиофилизация на ночь при вакууме 0,010 мБар и -85 °C.
- Отделите полипузырьки от высушенного КМЦ с помощью щипцов и промойте полипузырьки водой DI, чтобы удалить остатки КМЦ. Следует отметить, что можно использовать и другие полимеры, вероятно, с модификациями для изменения кинетики высвобождения.
3. Модуляция диаметра полипузырьков
- Наполните стеклянный флакон объемом 0,92 мл 10% CMC с помощью передаточной пипетки объемом 1 мл.
- Смешайте PCL/PCLTA в соотношении 1:3 (об/об.) с 1000 мг/мл 14 кДа PCL и синтезируйте PCLTA. Смешайте фотоинициатор с полимерной смесью в соотношении 0,005:1 (об/об.).
- Загрузите полимерную смесь в стеклянный шприц объемом 1 мл, установленный на шприцевом насосе, который соединен с дозирующей трубкой из нержавеющей стали с внутренним диаметром 0,016 дюйма.
- Используйте микромотор для управления движением полимерной трубки вперед и назад, чтобы ввести полимер в 10% CMC в стеклянном флаконе для образования полипузырька.
- Для получения полипузырьков различного диаметра варьируют скорость дозирования от 0,0005 до 1 мкл/с.
- Сделайте снимки флакона с полипузырьками разного диаметра.
- Используйте ImageJ для количественной оценки диаметра полипузырьков и используйте размер флакона в качестве шкалы.
4. Центрирование груза внутри полипузыря
- Модуляция вязкости PCL/PCLTA с помощью K2CO3:
заметка: Вязкость PLGADA не нужно изменять с помощью K2CO3, поскольку вязкость PLAGDA 5 кДа при концентрации 1000 мг/мл достаточна для центрирования груза.
- Добавьте K2CO3 (который был выделен после реакции PCLTA) к PCLTA в различных концентрациях, включая 0 мг/мл, 10 мг/мл, 20 мг/мл, 40 мг/мл и 60 мг/мл.
- Измерьте динамическую вязкость растворов, изменяя скорость сдвига от 0 до 1000 1/с с помощью реометрии.
- Вручную введите груз в середину (см. шаг 4.2 для приготовления грузовой смеси) полипузырьков, которые были образованы с использованием растворов PCL/PCLTA с различными концентрациями K2CO3 (шаг 4.1.1). Определите оптимальную концентрациюК2СО3, наблюдая, какой раствор из шага 4.1.1 может привести к удержанию груза в середине.
- Центрирование груза (уже показана целесообразность с малыми молекулами) с помощью КМЦ
- Смешайте груз с 5% (масс./об.) CMC в ротаторе на ночь, чтобы увеличить вязкость груза.
- Вручную введите 2 мкл грузовой смеси в полипузырь и продолжайте УФ-отверждение на длине волны 254 нм в течение 60 с при 2 Вт/см2.
- Мгновенную заморозку полипузырьков в жидком азоте на 30 с и лиофилизацию в течение ночи при вакууме 0,010 мБар и -85 °C.
- Отделите полипузырьки от высушенного КМЦ с помощью щипцов и промойте водой DI, чтобы удалить остатки КМЦ.
- Разрежьте полипузырь пополам и сфотографируйте половинки с помощью конфокальной микроскопии, чтобы убедиться, что груз центрирован (см. шаг 6 для используемых длин волн возбуждения и излучения).
5. Формулировка груза
ПРИМЕЧАНИЕ: Состав Polybubble может содержать различные типы грузов, включая малые молекулы, белки и нуклеиновые кислоты.
- Основываясь на предыдущих исследованиях, в случае белкового груза используйте вспомогательные вещества, включая полиэтиленгликоль (ПЭГ), поливинилпирролидон (ПВП) и гликополимеры, для улучшения стабильности белка во время приготовления полипузырьков.
- Формируем полипузыри на основе протокола в шаге 2.
- Приготовьте раствор антигена, добавив 17,11 г трегалозы к 625 мкл антигена ВИЧ gp120/41.
- Вручную введите 1 мкл раствора антигена в середину полипузыря.
- Открывают полипузырьки на 0, 7, 14 и 21 день и регистрируют флуоресценцию антигена с длинами волн возбуждения и излучения 497 нм и 520 нм соответственно.
- Определите функциональность антигена с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и используйте 5% обезжиренного молока в качестве блокирующего буфера.
6. Выдача груза
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве типа груза можно использовать малую молекулу или антиген
- Малые молекулы
- Инкубировать полипузырьки с центрированным акрифлавином в 400 мкл фосфатного буферного раствора (PBS) при 37 °C, 50 °C для полипузырьков PLGADA и при 37 °C, 50 °C, 70 °C для полипузырьков PCL/PCLTA.
заметка: Причина, по которой мы рекомендуем проводить испытания выше температуры тела, заключается в том, чтобы: а) смоделировать температуру (50 °C), при которой полипузырь достигает при лазерном воздействии на золотые наностержни (AuNR) в PCL и PLGA; и b) ускорить процесс разложения PCL (50 °C, 70 °C).
- В каждый момент времени собирайте надосадочную жидкость и заменяйте 400 мкл свежей PBS.
- Используйте планшетный ридер для количественной оценки интенсивностей флуоресценции в собранных надосадочной жидкости.
заметка: Используйте ex/em 416 нм/514 нм для акрифлавина.
- антиген
- Инкубируют полипузырьки с центрированной сывороткой бычьего альбумина (BSA)-488 в 400 мкл PBS при 37 °C, 50 °C для полипузырьков PLGADA и при 37 °C, 50 °C для полипузырьков PCL/PCLTA.
- В каждый момент времени собирайте надосадочную жидкость и заменяйте ее на 400 мкл свежей PBS.
- Используйте планшетный ридер для количественной оценки интенсивности флуоресценции в собранных надосадочных жидкостях. Используйте ex/em 497 нм/520 нм для BSA-488.
заметка: Исследование высвобождения полипузырьков PCL/PCLTA при 70 °C не следует проводить, чтобы избежать воздействия на антиген экстремальных температур.