Анализ для оценки противоопухолевого действия надосадочной жидкости Lactobacillus Cell-Free

Аннотация

Источник: Lee, J., et al. Оценка клеточной смерти с использованием бесклеточного супернатанта пробиотиков в трехмерных сфероидных культурах клеток колоректального рака. J. Vis. Exp. (2020).

Это видео демонстрирует анализ in vitro для изучения противораковых эффектов безклеточного супернатанта Lactobacillus (LCFS). При воздействии на сфероиды колоректального рака различных доз LCFS взаимодействие с бактериальными метаболитами в LCFS вызывает апоптоз в раковых клетках, нарушая структуру сфероида и приводя к гибели клеток дозозависимым образом.

Протокол

1. Бактериальные клеточные культуры и получение безклеточного надосадочного агента Lactobacillus (LCFS)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 1.2 – 1.9 проводятся в анаэробной камере.

1. Приготовьте агаровую тарелку Де Мана-Рогозы-Шарпа (MRS) и бульон, содержащий L-цистеин, и стерилизуйте путем автоклавирования.
2. Предварительно инкубируйте агаровую тарелку MRS в анаэробной камере_H2 при температуре 37 °C с 20 ppm кислорода.
3. Разморозьте бактериальный запас Lactobacillus и инокулируйте агаровую пластину бактериальной культурой (Рисунок 1A (i)).
4. Инкубируйте бактерии в течение 2 - 3 дней в анаэробной камере H₂ при 37 °C и 20 ppm кислорода до получения одиночных колоний бактерий.
5. Вымойте и высушите анеробическую пробирку для культуры типа Hungate. Автоклав питательной пробирки при 121 °С в течение 15 мин.
6. Затем инкубируйте трубку в анаэробной камере_Н2 при 37 °C и 20 ppm кислорода для удаления кислорода.
7. Поместите в пробирку 2 - 3 мл отвара MRS. Закупорьте трубку пробкой из бутилкаучука и закрутите крышку.
8. Получите одну колонию с петлей и поместите ее в культуральную пробирку объемом 1,5 мл с 500 мкл 1x PBS. (Рисунок 1А (ii)).
9. Подвешивайте колонию с помощью шприца объемом 1 мл (рис. 1A (iii)). Для этого введите иглу шприца объемом 1 мл в центр крышки пробирки, аспирируйте взвешенную колонию, а затем снова введя ее обратно в среду для бульона MRS. (Рисунок 1A (iv)).
10. Инкубировать среду для бульона MRS в шейкере-инкубаторе в течение 2 суток (37 °C, 5% CO₂, 200 об/мин).
11. Измерьте оптическую плотность (OD) с помощью спектрофотометра для мониторинга кривых роста бактерий до тех пор, пока поглощение при OD₆₂₀ не достигнет 2,0.
12. Отделите бактериальные гранулы и кондиционированную среду центрифугированием при 1 000 x g в течение 15 мин. Промойте собранные бактериальные гранулы 1x PBS и повторно суспендируйте в 4 мл RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Не стоит включать в состав среды какие-либо антибиотики.
13. Выдерживайте бактериальные гранулы в RPMI и инкубируйте в шейкерном инкубаторе в течение 4 ч при 37 °C с 5%_CO2 со скоростью 100 об/мин.
14. Для приготовления пробиотической надосадочной жидкости удалите бактериальную гранулу центрифугированием при 1000 x g в течение 15 мин при 4 °C. Стерильно отфильтруйте восстановленную надосадочную жидкость с помощью фильтра 0,22 мкм и храните при температуре −80 °C до использования.

2. Генерация сфероидов

1. Подготовка клеточных линий колоректального рака
   1. Выращивайте клеточные линии DLD-1, HT-29 и WiDr в виде монослоев до 70-80% конфлюенции и инкубируйте планшет при 37 °C в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 (Питательная среда: RPMI, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина).
   2. Для клеток, выращенных в чашке Петри 100 мм, дважды промойте планшет 4 мл 1x PBS. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубируйте чашку Петри в течение 2 мин при 37 °C в инкубаторе с 5%_CO2 для диссоциации клеток.
   3. После инкубации проверьте диссоциацию клеток под микроскопом и нейтрализуйте трипсин-ЭДТА 5 мл питательной среды.
   4. Перенесите диссоциированные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте в течение 3 минут при давлении 300 x g.
   5. Выбросьте надосадочную жидкость и аккуратно восстановите суспендию с 3 мл питательной среды.
   6. Подсчитайте клетки трипановым синим, чтобы определить жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра. (Рисунок 1B (i))
2. Сфероидальная формация
   1. В конической пробирке объемом 15 мл разбавьте клетки с 2.1.5 до получения 1 - 2 x 10⁵ клеток/мл (рис. 1B (ii))
   2. Добавьте в клеточную суспензию конечную концентрацию 0,6% метилцеллюлозы и перенесите разведенные клетки в стерильный резервуар.
      Примечание: Для каждой клеточной линии необходимо титровать необходимое количество метилцеллюлозы и определять его соответствующим образом.
   3. Используйте многоканальную пипетку для дозирования 200 мкл клеток в каждую лунку 96-луночного микропланшета со сверхнизким уровнем прикрепления с круглым дном. (Рисунок 1B (iii))
   4. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 в течение 24–36 часов.
   5. Через 24 - 36 ч рассмотрите пластину под световым микроскопом, чтобы убедиться в формировании сфероида.

3. Лечение 3D клеток колоректального рака с помощью LCFS

1. Сгенерируйте сфероиды, как описано в шагах 2 и 3.
2. Перед проведением процедуры LCFS разморозьте замороженный LCFS при комнатной температуре (RT) в течение 10 - 20 минут.
3. Инокулируйте стоковый раствор LCFS в питательную среду. Последовательно разбавляйте до 25%, 12,5% и 6% в питательной среде (т.е. 25% LCFS = 150 μл питательной среды + 50 μл LCFS).
4. Извлеките из инкубатора планшет для культивирования клеток, содержащий сфероиды, и удалите как можно больше питательной среды из каждой лунки с помощью пипетки объемом 200 мкл.
5. Добавьте питательную среду с LCFS на клетки и инкубируйте при 37 °C в инкубаторе с 5%_CO2 в течение 24 - 48 г.<бр/> заметка: Используемый объем будет зависеть от размера планшета следующим образом: 2 мл для 6-луночных планшетов для клеточных культур; 200 мкл для 96-луночных планшетов для культивирования клеток.

Результаты

Рисунок 1: Схематическое изображение формирования сфероидов и подготовки LCFS.

(A) Схематические изображения протокола генерации LCFS помечены (i-iv) (B) Схемы образования сфероида, опосредованного метилцеллюлозой, помечены (i-iii).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Применяемая оптическая адгезивная пленка Biosystems MicroAmp	Thermo Fisher Scientific	4311971	100 крышек
Axygen 2,0 мл Микроцентрифуга MaxyClear Snaplock, полипропилен, прозрачный, нестерильный, 500 пробирок/упаковка, 10 упаковок/кейс	Корнинг	SCT-200-C	500 туб/уп, 10 упаковок/кейс
BD Difco Бакто Агар	БД	No 214010	500 г
BD Difco Lactobacilli MRS Бульон	БД	ДФ0881-17-5	500 г
Corning Фосфатно-солевой буфер, 1X без кальция и магния, PH 7,4 ± 0,1	Корнинг	21-040-ЧВ	500 мл
Falcon 5 мл Пробирка из полистирола с круглым дном, с защелкивающимся колпачком для ячеек	Корнинг	352235	25/Упаковка, 500/Кейс
Фетальная бычья сыворотка, сертифицированная, происхождение из США	Thermo Fisher Scientific	16000044	500 мл
Lactobacillus fermentum	Корейская коллекция для типовых культур	ККТК 3112
L-цистеина гидрохлорида моногидрат	Сигма-Олдрич	С6852-25Г	25 г
Метилцеллюлоза (3500-5600 мПа·с, 2% в воде при 20°C)	ОТК	М0185	500 г
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate со штрих-кодом, 0,1 мл	Прикладные биосистемы	4346906	20 тарелок
Millex-GS Шприцевой фильтрующий блок, 0,22 мкм, смешанные эфиры целлюлозы, 33 мм, этиленоксид стерилизованный	Многородность	SLGS033SB	250
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 мл
РПМИ-1640	Gibco	11875-119 гг.	500 мл
Трипсин-ЭДТА (0,25%), фенол красный	Thermo Fisher Scientific	25200056	100 мл
Материалы/Оборудование/Программное обеспечение
Инкубатор CO2	Термофишер	ГЕРАСЕЛЛ 150i
Коническая трубка 15 мл	уровень звукового давления	50015
Коническая туба 50 мл	уровень звукового давления	50050
Corning Costar Сверхнизкое крепление многолуночной пластины	Сигма-Олдрич	CLS7007
Corning Costar Сверхнизкое крепление многолуночной пластины	Сигма-Олдрич	CLS3471
Costar 50 мл Резервуары для реагентов, 5 мл, стерильные	Костар	No 4870
Камеры подсчета клеток графини Слайды	Термофишер	С10228
Countess II FL Автоматизированный счетчик ячеек	Инвитроген	AMQAF1000
Многорежимный считыватель EnSpire	Перкин Элмер		Накопитель Enspire 2300
Многоканальный дозатор Eppendorf Research Plus, 8-канальный	Эппендорф	3122000051
Инкубационный шейкер	Компаньон по лаборатории	СИФ-6000Р
Мультикалибр версии 3.0,	Компания Fujifilm		Токио, Япония
УФ/ВИД спектрофотометры оптической плотности (OD) лямбда	Перкин Элмер		Уолтем, штат Массачусетс, США
Фазово-контрастный микроскоп	Олимп		Токио, Япония
Микроцентрифужная трубка SPL 1,5 мл	уровень звукового давления	Номер 60015
Многоканальные резервуары SPL, 12-CHS, PS, стерильные	уровень звукового давления	21012
Ультразвуковые жидкостные процессоры Vibra-Cell	Вибрационная ячейка SONICS	ВК 505	Ультразвуковой процессор мощностью 500 Вт
Виниловая анаэробная камера	ПРОДУКТЫ COY LAB

г.