Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Обработка пуповинной крови и выделение гемопоэтических стволовых/прогениторных клеток человека (ГСК)
- Выполняйте все этапы протокола в стерильных условиях в ламинарных шкафах.
- Возьмите пуповинную кровь (КБ), собранную в гепаринизированные пробирки, и доведите объем до 35 мл путем добавления фосфатно-солевого буфера (ПБС). Нанесите слой образца поверх среды для разделения лимфоцитов (LSM), как показано на рисунке 1, и центрифугируйте LSM со слоистой CB при 400 x g в течение 35 минут при 4 °C без тормозов.
заметка: Разбавляйте кровь осторожно и аккуратно, чтобы избежать смешивания на границе раздела.
- Осторожно снимите верхний слой LSM и плазмы и перенесите интерфейс белого охристого покрытия на новую пробирку с помощью переводной пипетки.
- Ресуспендировать охристую шерсть в 30 - 40 мл ледяного буфера (PBS + 0,5% бычьего сывороточного альбумина [BSA] + 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты [ЭДТА]). С помощью пипетки смешайте 20 мкл клеточной суспензии с 20 мкл 0,4% трипанового синего и внесите пипеткой 10 мкл смеси во внешнее отверстие любой из двух камер счетного стекла и вставьте предметное стекло в автоматический счетчик клеток для подсчета клеток.
заметка: Используйте ледяной буфер на всех этапах, так как он помогает сохранить клетки жизнеспособными.
- Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 10 минут при 4 °C и тщательно отаскайте надосадочную жидкость. Затем добавьте 300 μL ледяного буфера.
- Добавьте 100 мкл реагента, блокирующего Fc-рецептор человека, и 100 мкл микрогранул, конъюгированных с антителами моноклональных мышей против человеческого CD34, для получения до 1 x 108 клеток (см. Таблицу материалов). Инкубировать в течение 30 минут при 4 °C, добавить 10 мл ледяного буфера для промывки клеток и центрифугировать при 300 x g в течение 10 минут при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличьте масштаб в соответствии с номером ячейки, если присутствует более 1 x 108 ячеек.
- Осторожно удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл буфера и перейдите к этапу магнитной сепарации для обогащения HSPC.
- Поместите столбец LS положительного выбора (см. Таблицу материалов) в поле сортировки магнитных элементов и пропустите его через него с 3 мл буфера.
- Загрузите образец в колонку LS, которая может захватывать микрогранулы, связанные с человеческим CD34+ в образцах, и позволять ему течь под действием силы тяжести в пробирку для сбора.
- Промойте колонку 3 раза с буфером и соберите элюирование в той же пробирке для сбора CD34-фракции клеток.
- Погрузите в колонку 5 мл буфера, чтобы элюировать клетки CD34+ в новую пробирку для сбора. Повторите процедуру для достижения чистоты >90%.
- Подсчитайте элюированные CD34+ клетки с помощью трипанового синего красителя в гемоцитометре. После подсчета центрифугируйте клетки CD34+ при 300 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендировать CD34+ клетки в 25 мкл PBS для инъекции для немедленного использования при трансплантации или криоконсервировать клетки в концентрации 1-2 млн/мл в замораживающей среде (среда Roswell Park Memorial Institute [среда RPMI 1640] + 50% фетальная бычья сыворотка (FBS) + 10% диметилсульфоксид [DMSO]) для дальнейшего использования в трансплантации.
заметка: Всегда пересчитывайте жизнеспособные клетки перед использованием их в трансплантации.
- Чтобы проверить чистоту элюата CD34+, возьмите 50 мкл суспензии и инкубируйте ее с 10 мкл фикоэритрина или ПЭ-конъюгированного антитела к человеческому CD34 в течение 30 мин при 4 °C. После инкубации антител окрашенные клетки промыть PBS, повторно суспендировать их в 100 мкл PBS, а затем приступить к выполнению проточной цитометрии. Добавьте дополнительную пробирку с клетками без антител, чтобы сконструировать ворота в проточном цитометре.
- После сбора данных проанализируйте данные, выбрав интересующую область на графике прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC), а затем стробирование для отдельных ячеек на графиках FSC-области и FSC-высоты. Gate CD34-положительные клетки на одиночных клетках в PE-канале и на графике SSC-области.
2. Подготовка гепатоцитов человека (ГЭП) к трансплантации
- Извлеките криоконсервированные гепатоциты из жидкого азота, быстро погрузите флакон в водяную баню и оттаивайте примерно 90 - 120 с.
- Снимите крышку флакона и вылейте размороженные гепатоциты в коническую пробирку объемом 50 мл подогретой размораживающей среды.
- Подвесьте клетки, покачивая 50 мл пробирки вручную в течение нескольких секунд.
заметка: Не закручивайте трубку.
- Гранулируйте ячейки при 100 х г в течение 8 минут при комнатной температуре. Промойте гранулированные ячейки в PBS с 0,1% BSA и объедините их со свежими или размороженными HSPC (соотношение 10:1) в PBS в конечном объеме 80 μл/мышь.
3. Обращение с животными, скрининг, генотипирование и лечение для трансплантации ГСКХ человека и гепатоцитов
- Обращение с животными
- В результате тяжелого иммунодефицита разводите, содержите и обрабатывайте мышей TK-NOG в асептических условиях.
- Всегда надевайте лабораторный халат, перчатки, бахилы и маску для лица, чтобы предотвратить заражение потенциально патогенными микроорганизмами.
- Используйте стерильные перчатки и инструменты для хирургии и обращайтесь с животными асептически на протяжении всей операции.
- Отбор мышей TK-NOG для эксперимента
- Поддерживайте колонию штамма TK-NOG путем скрещивания самок мышей TK-NOG с самцами однопометников, не относящимися к TK-NOG, и отбирайте трансгенное потомство путем генотипирования.
заметка: Проведите генотипирование (см. шаг 3.3) для определения наличия или отсутствия трансгена у новорожденных мышей мужского и женского пола на момент отъема.
- Отбирают для трансплантации мужчин в возрасте 6 - 8 недель из-за их высокой чувствительности к GCV-опосредованному истощению трансген-экспрессирующих гепатоцитов ВПГ-ТЗ.
- Наклейте ушные бирки на мышей во время отлучения от груди или хирургического вмешательства, чтобы облегчить идентификацию. Запишите вес и состояние здоровья животных.
- Генотипирование на наличие трансгена HSV-TK с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени
- Проводят генотипирование в момент отъема (обычно в возрасте 3 - 4 недель). Для генотипирования отрежьте кусочек уха мыши в шкафу биологической безопасности с ламинарным потоком, чтобы сохранить стерильность и извлечь геномную ДНК с помощью набора для выделения геномной ДНК.
- Амплификация геномной ДНК, выделенной из ушного наконечника, в реакционной смеси объемом 20 мкл для скрининга трансгена HSV-TK под контролем промотора альбумина человека путем добавления 1 мкл прямого праймера 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 мкл обратного праймера 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3', 0,5 мкл зонда FAM 5'-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3', и 10 мкл мастер-смеси на приборе для полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени.
- Установите следующие настройки ПЦР в реальном времени: 60 °C в течение 30 с (стадия предварительного считывания), 95 °C в течение 10 мин (стадия удержания), 40 циклов 95 °C в течение 15 с и 60 °C в течение 1 мин (стадия ПЦР) и 60 °C в течение 30 с (стадия после считывания).
заметка: Цикл порога (Ct) ниже 22 считается положительным для трансгена ВПГ-ТЗ.
- Лечение с помощью ганцикловира и треосульфана
- Используя иглу 27 G, вводите мышам TK-NOG внутрибрюшинные инъекции GCV (6 мг/кг) 2 раза в день на 7-й и на 5-й день по 100 мкл физиологического раствора перед операцией для истощения трансгенных паренхиматозных клеток мышей (как показано в экспериментальной стратегии на рисунке 2).
- На 3, 2 и 1 день до операции мышам вводили немиелоаблативные внутрибрюшинные дозы треосульфана (1,5 г/кг/сут) в 100 мкл физиологического раствора с помощью иглы 27 г.
- За день до операции возьмите две-три капли (~100 мкл) крови из подчелюстной вены, проколов ее 5 мм ланцетом, и выделите сыворотку путем центрифугирования (1500 x g в течение 10 мин при 4 °C) для анализа аланинаминотрансферазы (АЛТ) для оценки степени повреждения печени.
- Подготовка к операции
- Перед операцией используйте машинку для стрижки, чтобы сбрить шерсть мыши вокруг места разреза (слева от стенки брюшины).
- Отрегулируйте поток кислорода до 1 л/мин и поток изофлурана до 3% - 5% в индукционной камере с помощью аппарата для анестезии мышей. Помещайте по одной мыши в индукционную камеру для анестезии.
- Присоедините один конец стерильной удлинительной трубки (с емкостью 550 мкл суспензии; технические характеристики см. в Таблице материалов) к игле 30 G, а другой конец к шприцу объемом 1 мл.
- Заполните шприц суспензией (80 мкл/мышь) объединенных ГЭП и ГСКХ (см. раздел 2), вставьте шприц в выемку повторяющейся дозирующей пипетки и отрегулируйте дозатор так, чтобы он дозировал 10 мкл в каждом прессе.
После того, - как мыши будут обезболены (обычно через 3 - 4 минуты), переключите поток изофлурана на носовой конус и уменьшите скорость потока изофлурана до 2% - 3%.
- Внутриселезеночная трансплантация ГСК и гепатоцитов человека у мышей
- Выполняйте все хирургические операции в ламинарном шкафу в стерильных условиях.
- Положите чистую стерильную простыню на рабочую поверхность и потрите левую сторону тела каждой мыши 10 % повидон-йодом, а затем 70 % изопропиловым спиртом, прежде чем сделать надрез.
- Сделайте небольшой разрез (~1 - 1,5 см в длину и 5 мм в глубину) на коже, мышце и брюшине слева от стенки брюшины с помощью ножниц типа Ванны, чтобы войти в брюшную полость примерно на 5 мм ниже нижнего края грудной клетки.
- Найдите селезенку, слегка подтяните ее щипцами к операционной области для легкого доступа и введите иглу 30 G в нижний полюс селезенки.
- Разблокируйте поршень дозирующей пипетки и выдайте 10 мкл объема за один раз, с ограничением 60-80 мкл на селезенку. Медленно втяните иглу и зафиксируйте селезенку лигирующими зажимами с помощью аппликатора для лигирования.
- Протолкните селезенку обратно в полость тела с помощью аппликаторов с ватными наконечниками, смоченных стерильным PBS.
- Закройте мышечный слой брюшной стенки с помощью рассасывающегося шва прерывистым швом (не непрерывным). Завершите закрытие кожи прерывистым швом с помощью нерассасывающихся швов.
