Разработка гуманизированной мышиной модели с клетками печени человека и иммунными клетками

Abstract

Источник: Dagur, R. S. et al., Создание модели двойной гуманизированной мыши TK-NOG для ВИЧ-ассоциированного патогенеза печени.J. Vis. Exp.(2019)

Это видео демонстрирует метод создания двойной гуманизированной модели мыши с иммунной системой человека и клетками печени. Он включает в себя трансплантацию клеток печени человека и гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток трансгенной иммунодефицитной мыши путем внутриселезеночной инъекции, что приводит к приживлению клеток печени и развитию иммунных клеток человека.

Protocol

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Обработка пуповинной крови и выделение гемопоэтических стволовых/прогениторных клеток человека (ГСК)

1. Выполняйте все этапы протокола в стерильных условиях в ламинарных шкафах.
2. Возьмите пуповинную кровь (КБ), собранную в гепаринизированные пробирки, и доведите объем до 35 мл путем добавления фосфатно-солевого буфера (ПБС). Нанесите слой образца поверх среды для разделения лимфоцитов (LSM), как показано на рисунке 1, и центрифугируйте LSM со слоистой CB при 400 x g в течение 35 минут при 4 °C без тормозов.
   заметка: Разбавляйте кровь осторожно и аккуратно, чтобы избежать смешивания на границе раздела.
3. Осторожно снимите верхний слой LSM и плазмы и перенесите интерфейс белого охристого покрытия на новую пробирку с помощью переводной пипетки.
4. Ресуспендировать охристую шерсть в 30 - 40 мл ледяного буфера (PBS + 0,5% бычьего сывороточного альбумина [BSA] + 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты [ЭДТА]). С помощью пипетки смешайте 20 мкл клеточной суспензии с 20 мкл 0,4% трипанового синего и внесите пипеткой 10 мкл смеси во внешнее отверстие любой из двух камер счетного стекла и вставьте предметное стекло в автоматический счетчик клеток для подсчета клеток.
   заметка: Используйте ледяной буфер на всех этапах, так как он помогает сохранить клетки жизнеспособными.
5. Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 10 минут при 4 °C и тщательно отаскайте надосадочную жидкость. Затем добавьте 300 μL ледяного буфера.
6. Добавьте 100 мкл реагента, блокирующего Fc-рецептор человека, и 100 мкл микрогранул, конъюгированных с антителами моноклональных мышей против человеческого CD34, для получения до 1 x 10⁸ клеток (см. Таблицу материалов). Инкубировать в течение 30 минут при 4 °C, добавить 10 мл ледяного буфера для промывки клеток и центрифугировать при 300 x g в течение 10 минут при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличьте масштаб в соответствии с номером ячейки, если присутствует более 1 x 10⁸ ячеек.
7. Осторожно удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл буфера и перейдите к этапу магнитной сепарации для обогащения HSPC.
8. Поместите столбец LS положительного выбора (см. Таблицу материалов) в поле сортировки магнитных элементов и пропустите его через него с 3 мл буфера.
9. Загрузите образец в колонку LS, которая может захватывать микрогранулы, связанные с человеческим CD34+ в образцах, и позволять ему течь под действием силы тяжести в пробирку для сбора.
10. Промойте колонку 3 раза с буфером и соберите элюирование в той же пробирке для сбора CD34-фракции клеток.
11. Погрузите в колонку 5 мл буфера, чтобы элюировать клетки CD34⁺ в новую пробирку для сбора. Повторите процедуру для достижения чистоты >90%.
12. Подсчитайте элюированные CD34⁺ клетки с помощью трипанового синего красителя в гемоцитометре. После подсчета центрифугируйте клетки CD34⁺ при 300 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
13. Ресуспендировать CD34⁺ клетки в 25 мкл PBS для инъекции для немедленного использования при трансплантации или криоконсервировать клетки в концентрации 1-2 млн/мл в замораживающей среде (среда Roswell Park Memorial Institute [среда RPMI 1640] + 50% фетальная бычья сыворотка (FBS) + 10% диметилсульфоксид [DMSO]) для дальнейшего использования в трансплантации.
    заметка: Всегда пересчитывайте жизнеспособные клетки перед использованием их в трансплантации.
14. Чтобы проверить чистоту элюата CD34⁺, возьмите 50 мкл суспензии и инкубируйте ее с 10 мкл фикоэритрина или ПЭ-конъюгированного антитела к человеческому CD34 в течение 30 мин при 4 °C. После инкубации антител окрашенные клетки промыть PBS, повторно суспендировать их в 100 мкл PBS, а затем приступить к выполнению проточной цитометрии. Добавьте дополнительную пробирку с клетками без антител, чтобы сконструировать ворота в проточном цитометре.
15. После сбора данных проанализируйте данные, выбрав интересующую область на графике прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC), а затем стробирование для отдельных ячеек на графиках FSC-области и FSC-высоты. Gate CD34-положительные клетки на одиночных клетках в PE-канале и на графике SSC-области.

2. Подготовка гепатоцитов человека (ГЭП) к трансплантации

1. Извлеките криоконсервированные гепатоциты из жидкого азота, быстро погрузите флакон в водяную баню и оттаивайте примерно 90 - 120 с.
2. Снимите крышку флакона и вылейте размороженные гепатоциты в коническую пробирку объемом 50 мл подогретой размораживающей среды.
3. Подвесьте клетки, покачивая 50 мл пробирки вручную в течение нескольких секунд.
   заметка: Не закручивайте трубку.
4. Гранулируйте ячейки при 100 х г в течение 8 минут при комнатной температуре. Промойте гранулированные ячейки в PBS с 0,1% BSA и объедините их со свежими или размороженными HSPC (соотношение 10:1) в PBS в конечном объеме 80 μл/мышь.

3. Обращение с животными, скрининг, генотипирование и лечение для трансплантации ГСКХ человека и гепатоцитов

1. Обращение с животными
   1. В результате тяжелого иммунодефицита разводите, содержите и обрабатывайте мышей TK-NOG в асептических условиях.
   2. Всегда надевайте лабораторный халат, перчатки, бахилы и маску для лица, чтобы предотвратить заражение потенциально патогенными микроорганизмами.
   3. Используйте стерильные перчатки и инструменты для хирургии и обращайтесь с животными асептически на протяжении всей операции.
2. Отбор мышей TK-NOG для эксперимента
   1. Поддерживайте колонию штамма TK-NOG путем скрещивания самок мышей TK-NOG с самцами однопометников, не относящимися к TK-NOG, и отбирайте трансгенное потомство путем генотипирования.
      заметка: Проведите генотипирование (см. шаг 3.3) для определения наличия или отсутствия трансгена у новорожденных мышей мужского и женского пола на момент отъема.
   2. Отбирают для трансплантации мужчин в возрасте 6 - 8 недель из-за их высокой чувствительности к GCV-опосредованному истощению трансген-экспрессирующих гепатоцитов ВПГ-ТЗ.
   3. Наклейте ушные бирки на мышей во время отлучения от груди или хирургического вмешательства, чтобы облегчить идентификацию. Запишите вес и состояние здоровья животных.
3. Генотипирование на наличие трансгена HSV-TK с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени
   1. Проводят генотипирование в момент отъема (обычно в возрасте 3 - 4 недель). Для генотипирования отрежьте кусочек уха мыши в шкафу биологической безопасности с ламинарным потоком, чтобы сохранить стерильность и извлечь геномную ДНК с помощью набора для выделения геномной ДНК.
   2. Амплификация геномной ДНК, выделенной из ушного наконечника, в реакционной смеси объемом 20 мкл для скрининга трансгена HSV-TK под контролем промотора альбумина человека путем добавления 1 мкл прямого праймера 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 мкл обратного праймера 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3', 0,5 мкл зонда FAM 5'-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3', и 10 мкл мастер-смеси на приборе для полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени.
   3. Установите следующие настройки ПЦР в реальном времени: 60 °C в течение 30 с (стадия предварительного считывания), 95 °C в течение 10 мин (стадия удержания), 40 циклов 95 °C в течение 15 с и 60 °C в течение 1 мин (стадия ПЦР) и 60 °C в течение 30 с (стадия после считывания).
      заметка: Цикл порога (Ct) ниже 22 считается положительным для трансгена ВПГ-ТЗ.
4. Лечение с помощью ганцикловира и треосульфана
   1. Используя иглу 27 G, вводите мышам TK-NOG внутрибрюшинные инъекции GCV (6 мг/кг) 2 раза в день на 7-й и на 5-й день по 100 мкл физиологического раствора перед операцией для истощения трансгенных паренхиматозных клеток мышей (как показано в экспериментальной стратегии на рисунке 2).
   2. На 3, 2 и 1 день до операции мышам вводили немиелоаблативные внутрибрюшинные дозы треосульфана (1,5 г/кг/сут) в 100 мкл физиологического раствора с помощью иглы 27 г.
   3. За день до операции возьмите две-три капли (~100 мкл) крови из подчелюстной вены, проколов ее 5 мм ланцетом, и выделите сыворотку путем центрифугирования (1500 x g в течение 10 мин при 4 °C) для анализа аланинаминотрансферазы (АЛТ) для оценки степени повреждения печени.
5. Подготовка к операции
   1. Перед операцией используйте машинку для стрижки, чтобы сбрить шерсть мыши вокруг места разреза (слева от стенки брюшины).
   2. Отрегулируйте поток кислорода до 1 л/мин и поток изофлурана до 3% - 5% в индукционной камере с помощью аппарата для анестезии мышей. Помещайте по одной мыши в индукционную камеру для анестезии.
   3. Присоедините один конец стерильной удлинительной трубки (с емкостью 550 мкл суспензии; технические характеристики см. в Таблице материалов) к игле 30 G, а другой конец к шприцу объемом 1 мл.
   4. Заполните шприц суспензией (80 мкл/мышь) объединенных ГЭП и ГСКХ (см. раздел 2), вставьте шприц в выемку повторяющейся дозирующей пипетки и отрегулируйте дозатор так, чтобы он дозировал 10 мкл в каждом прессе.
   После того,
   5. как мыши будут обезболены (обычно через 3 - 4 минуты), переключите поток изофлурана на носовой конус и уменьшите скорость потока изофлурана до 2% - 3%.
6. Внутриселезеночная трансплантация ГСК и гепатоцитов человека у мышей
   1. Выполняйте все хирургические операции в ламинарном шкафу в стерильных условиях.
   2. Положите чистую стерильную простыню на рабочую поверхность и потрите левую сторону тела каждой мыши 10 % повидон-йодом, а затем 70 % изопропиловым спиртом, прежде чем сделать надрез.
   3. Сделайте небольшой разрез (~1 - 1,5 см в длину и 5 мм в глубину) на коже, мышце и брюшине слева от стенки брюшины с помощью ножниц типа Ванны, чтобы войти в брюшную полость примерно на 5 мм ниже нижнего края грудной клетки.
   4. Найдите селезенку, слегка подтяните ее щипцами к операционной области для легкого доступа и введите иглу 30 G в нижний полюс селезенки.
   5. Разблокируйте поршень дозирующей пипетки и выдайте 10 мкл объема за один раз, с ограничением 60-80 мкл на селезенку. Медленно втяните иглу и зафиксируйте селезенку лигирующими зажимами с помощью аппликатора для лигирования.
   6. Протолкните селезенку обратно в полость тела с помощью аппликаторов с ватными наконечниками, смоченных стерильным PBS.
   7. Закройте мышечный слой брюшной стенки с помощью рассасывающегося шва прерывистым швом (не непрерывным). Завершите закрытие кожи прерывистым швом с помощью нерассасывающихся швов.

Results

Рисунок 1: Схема обогащения CD34⁺ клеток из пуповинной крови.(A) Пуповинная кровь наносится слоями на среду разделения лимфоцитов (LSM) и центрифугируется для выделения охристой шерсти. (B) Колонны LS помещаются на магнитную подставку и промываются буфером BSA с последующим нанесением охристого слоя. Клетки, положительные на CD34, задерживаются в колонках,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Иглы 27G1/2"	BD бионауки	305109
Иглы 30G1/2"	BD бионауки	305106
5 мл полистирольная трубка с круглым дном 12 x 75 мм	Корнинг	352054
BD 1 мл туберкулиновый шприц без иглы	BD бионауки	309659
Матричный биоанализатор BD FACS	BD Biosciences		Для проверки чистоты элюированных CD34+ клеток
Программное обеспечение массива BD FACS	BD Biosciences		Программное обеспечение для анализа полученной CD34+ клетки на FACS матрице
Решение для лизинга BD FACS	BD Biosciences	349202	Для лизиса эритроцитов
BD LSR II	BD Biosciences		Прибор для получения образцов проточной цитометрии
BD Vacutainer Пластиковая пробирка для сбора крови	BD бионауки	БД 367874	Сбор пуповинной крови
Бычий сывороточный альбумин	Сигма-Олдрич	А9576
CD34 Набор микрошариков, человеческий	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-046-702	Для изоизации CD34+ HSPC
CD34-PE, человек	Милтеньи Биотек	130-081-002 (Английский)	Антитела, используемые для проверки чистоты элюированных CD34+ клеток
Слайды для подсчета ячеек	Био-рад	1450015
Набор салфеток ChargeSwitch gDNA Mini	Thermofisher scientific	CS11204	Для извлечения геномной ДНК из ушного вкладыша
Аппликаторы с ватными наконечниками	Маккессон	24-106-2С
ДМСО (диметилсульфоксид)	Сигма-Олдрич	Д2650-5Х5МЛ
Комплект удлинителей Микроотверстие Скользящий зажим (ы) Фиксированный замок Люэра с наружной резьбой. L: 60 in L: 152 см PV: 0,55 мл Путь жидкости стерильный	BD бионауки	No 30914	Прикрепляется к дозирующему пипету и загружается с помощью HSPC и HEP suspesion
FACS Diva версия 6	BD Biosciences		Программное обеспечение проточного цитометра, необходимое для получения образца
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Gibco	10438026
Программное обеспечение для анализа FLOWJO v10.2	ФЛОУДЖО, ООО		Программное обеспечение для анализа проточной цитометрии
Ганцикловир	APP Pharmaceuticals, Inc.	315110 (Английский	Прописанные препараты
Трубки Greiner MiniCollect EDTA	Грайнер биоуан	450475
Среда для размораживания гепатоцитов	Исследовательские лаборатории Triangle	МХТ50
Аппликаторы с открытым лигирующим зажимом Horizon	Телефлекс	537061	Удержание лигирующих зажимов
Гепатоцит человека	Исследовательские лаборатории Triangle	ХУКП1	Криоконсервированные гепатоциты человека, квалифицированные для индукции
Ножницы с радужной оболочкой, прямые	Тед Пелла, Инк.	No 13295
ланцет	MEDIpoint	Золотарник 5 мм
Колонны LS	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-042-401	Используется для захвата микрогранул CD34+ (положительный отбор)
Среда для разделения лимфоцитов (LSM)	MP Biomedicals	No 50494	Для изоизации лимфоцитов из периферической крови
MACS MultiStand	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-042-303	Удерживает сепаратор Qudro MACS и колонны LS
Микродиссекционные пружинные ножницы McPherson-Vannas	Робоз Хирургический Инструмент Ко.	РС-5605	Используется для выполнения разреза на коже с целью обнажения селезенки
Микрорассекающие щипцы	Робоз Хирургический Инструмент Ко.	РС-5157	Удерживать и вытягивать селезенку из брюшинной полости
Мышь CD45-FITC	BD Biosciences	No 553080	Специфичные для мыши
PBS (фосфатно-солевой буфер)	Гиклон	SH30256.02
Сепаратор Qudro MACS	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-090-976	удерживает четыре колонны LS
RPMI 1640 средний	Gibco	11875093
StepOne Plus ПЦР в реальном времени	Прикладные биосистемы		Инструмент, используемый для генотипирования
Степпер серия Повторяющаяся дозирующая пипетка 1 мл	ДИМАКС КОРП	Т15469	Используется для дозирования HSPC и HEP supension контролируемым образом
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermofisher scientific	4369016
Автоматический счетчик ячеек TC20	Био-рад	1450102
Мыши TK-NOG			Предоставлено Центральным институтом экспериментальных животных (CIEA, Япония; д-ра Мамору Ито и Хироси Суэмидзу)
Треосульфан	Медак ГмбХ		Предоставлено д-ром Йоахимом Баумгартом (medac GmbH)
Трипан синий	Био-рад	1450022
Микроножницы типа Vannas, прямые, 80 мм L	Тед Пелла, Инк.	1346	Используется для выполнения разреза на коже с целью обнажения селезенки
Weck hemoclip традиционные титановые лигирующие клипсы	Есутурес	523700	Для перевязки селезенки после инъекции