Методика получения антиген-специфичных CAR-Т-клеток

Аннотация

Источник: Davidson, H. W., et al. высокоэффективная генерация антиген-специфических первичных цитотоксических Т-клеток мыши для функционального тестирования в модели аутоиммунного диабета. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует технику создания антиген-специфичных химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток с помощью ретровирусной трансдукции. Активированные мышиные CD8+ Т-клетки добавляют в микролуночный планшет, покрытый фрагментами рекомбинантного фибронектина. Затем вводятся ретровирусные векторы, содержащие трансгенную РНК, кодирующую антиген-специфический химерный антигенный рецептор (CAR), и планшет центрифугируют для облегчения трансдукции. После инкубации трансдуцированные клетки экспрессируют антиген-специфичные CAR на своей поверхности.

Протокол

1. Генерация и валидация одноцепочечных Fab-антител (scFab)-CARs.

ПРИМЕЧАНИЕ: CAR обычно содержат 3 критических домена — антиген-нацеленный домен, спейсерный/трансмембранный домен и цитоплазматический сигнальный домен. Точный дизайн каждого CAR зависит от предполагаемой мишени, и поэтому, помимо ключевых особенностей конструкции, имеющих отношение к генерации ретровируса, в данном протоколе подробно описываться не будет. Общая структура CAR, использованных для описанных ниже исследований, показана на рисунке 1. Вкратце, таргетный домен включает в себя всю легкую цепь и вариабельный и CH1-домен тяжелой цепи от родительского моноклонального антитела, связанного полужестким линкером. Спейсерный/трансмембранный домен взят из мышиного CD28, а сигнальный домен представляет собой слияние, содержащее элементы мышиного CD28, CD137 (4-1BB) и CD247 (CD3ζ). Эти элементы собираются с помощью стандартных процедур молекулярной биологии, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или синтез соответствующего «генного блока». Подробности о создании mAB287 CAR содержатся в работе Zhang et al. Последовательности кДНК могут быть получены у авторов по запросу.

1. Сборка конструкта CAR
   1. Синтезируйте целевое одноцепочечное Fab-антитело (scFab) и комбинированные спейсерные/сигнальные домены по отдельности и используйте технику «3-точечного» лигирования для сборки окончательной конструкции (рис. 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевым требованием к вкладышу CAR является то, что он должен содержать сайты эндонуклеазы фланкирующей рестрикции, позволяющие лигирование в ретровирусный экспрессирующий вектор pMSCV-IRES-GFP II (pMIG II) или родственные производные.
2. Валидация экспрессии поверхности CAR
   1. Трансдуцируют гибридомные клетки с помощью ретровирусных частиц, полученных из pMIG II, полученных по стандартному протоколу (например, Holst et al.).
   2. Проведите анализ проточной цитометрии для определения экспрессии GFP из вектора CAR.
   3. Окрашивание поверхностной экспрессии CAR трансдуцированных гибридом с использованием меченых антител против κ-цепи мыши (например, клон RMK-45).
3. Валидация специфичности CAR
   1. Стимулируйте трансдуцированные гибридомные клетки соответствующими пластинчатыми или клеточными антигенами. После совместного культивирования в течение ночи собирают надосадочную жидкость и секретируемые цитокины и анализируют с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале, каждый CAR должен быть независимо проверен перед использованием для трансдукции. На этом этапе эксперимент может быть приостановлен и возобновлен позже.

2. Трансфекция вирусных клеток-продуцентов (день - 4 - день 3)

ПРИМЕЧАНИЕ: Ретровирус производится с использованием клеток Phoenix-ECO (см. Таблицу материалов). Используйте соответствующие меры предосторожности для образования потенциально инфекционных агентов (предпочтительно включая специальный шкаф уровня биобезопасности 2 (BSL-2) и отдельный инкубатор для культивирования трансфицированных/трансдуцированных клеток).

1. Размораживание клеток Феникса (День -4)
   1. Разморозьте 2 x 10⁶ ячеек Феникс-Эко. Увеличьте количество клеток Phoenix, если планируется несколько трансдукций.
   2. Поместите их в 10-сантиметровую чашку для культуры тканей с 10 мл среды (модифицированная среда Dulbecco Eagle (DMEM), содержащая 10% эмбриональной сыворотки теленка (FCS)).
2. Прохождение клеток Феникса (День -3)
   1. Удалите жидкость и промойте 5 мл фосфатно-солевого буфера (DPBS) Дульбекко.
   2. Добавьте 3 мл 0,25% трипсина и инкубируйте при 37 °C при 10% CO₂ атмосферы в течение 3 минут.
   3. Соберите клетки и гранулируйте центрифугированием в течение 3 минут при концентрации 200 x g. Повторно залейте клетки 10 мл свежей среды и инкубируйте при 37 °C.
3. Облучение клеток Феникса (день -1 во второй половине дня)
   1. Чтобы свести к минимуму дальнейшее деление клеток, соберите клетки Феникса, как описано в шаге 2.2, ресуспендируйте в 5 мл среды и облучите клетки гамма-излучением на льду (1000 рад).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание облучения персонала следует соблюдать осторожность при проведении радиационных работ.
   2. Облученные клетки центрифугируют, ресуспендируют в свежей среде, проводят в планшете 2 x 10⁶ клеток (в 10 мл среды)/планшет/CAR и инкубируют.
4. Трансфекция (день 0 - утро)
   1. Аспирируйте надосадочную жидкость из клеток Феникса, промойте 5 мл фосфатно-физиологического буфера (PBS) и осторожно добавьте 7 мл восстановленной сывороточной среды (например, Opti-MEM) по каплям на боковую стенку пластины, чтобы не нарушить монослой. Перенесите клетки обратно в инкубатор.
   2. Возьмите две полипропиленовые пробирки с круглым дном по 14 мл и добавьте в каждую по 1,5 мл восстановленной сыворотки. В одну пробирку добавьте 40 мкл реагента для трансфекции (см. Таблицу материалов).
   3. В другую пробирку добавьте 15 г плазмиды Ab-CAR (полученной на этапе 1) и 5 г плазмиды оболочки и упаковки (5 г pCL-Eco). Инкубируйте пробирки при комнатной температуре в течение 5 минут.
   4. Добавьте смесь реагентов для трансфекции из шага 2.4.2 по каплям во вторую пробирку, не касаясь стенок пробирки, и перемешайте, осторожно дозируя раствор пипетированием вверх и вниз 3 раза. Выдерживать при комнатной температуре не менее 20 минут.
   5. Добавьте 3 мл смеси по каплям в клетки Феникса и поместите в инкубатор для тканевых культур.
   6. Через 4–5 ч добавьте 1 мл FCS. Культивировать клетки в течение ночи при 37 °C.
5. Средние изменения (День 1)
   1. Удалить надосадочную жидкость, содержащую комплексы плазмид/трансфекционный реагент, и утилизировать их в соответствии с институциональными процедурами работы с инфекционным материалом. Добавьте к клеткам 4 мл свежей, предварительно подогретой питательной среды.
6. Сбор вируса для трансдукции (день 2)
   1. Соберите вируссодержащую среду из клеток Феникса с помощью стерильного шприца, отфильтруйте (0,45 мкм) для удаления остаточного клеточного мусора и соберите в новую пробирку.
   2. Добавьте запас рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (rhIL-2) до конечной концентрации 200 международных единиц (МЕ)/мл. Немедленно используйте вирус для трансдукции (шаг 5.3). Добавьте в клетки Феникса 4 мл свежей среды и поместите в инкубатор.
7. Повторный сбор вирусов (День 3)
   1. Повторите шаг 2.6, но выбросьте клетки Феникса как инфекционные отходы вместо добавления свежей среды. Этот надосадочный слой используется на шаге 5.4.

3. Выделение и активация первичных CD8 Т-клеток (день -1 - день 0)

ПРИМЕЧАНИЕ: Ранее собирали CD8 Т-клетки у самок мышей с диабетом без ожирения (NOD) за 4–5 недель, за определенный момент времени до начала воспаления островков. Обращайтесь со всеми мышами в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию институциональных животных (IACUC). CD8 Т-клетки обогащаются из спленоцитов с использованием коммерческого набора для отрицательной селекции.

1. Покрытие планшетов антителами к CD3/CD28 (день -1)
   1. Добавьте 1 мл смеси антител против мышей CD3 и CD28 (оба в концентрации 1 мкг/мл в PBS) в каждую лунку 24-луночного планшета и инкубируйте при 4 °C в течение ночи.
   2. На следующий день промойте планшеты 1 мл стерильного PBS 3 раза перед добавлением мышиных CD8 Т-клеток (шаг 4.1).
      Примечание: Количество лунок, подлежащих покрытию, будет варьироваться для каждого эксперимента в зависимости от общего количества необходимых активированных CD8 Т-клеток.
2. Сбор спленоцитов (день 0)
   1. Усыпить двух самок мышей NOD в возрасте 4–5 недель с помощью ингаляции CO₂ с последующей обезглавливанием. Соберите селезенку и положите ее на клеточное ситечко, замоченное в 10 мл PBS в чашке для клеточных культур на льду.
   2. В колпаке для клеточных культур разрежьте каждую селезенку на 3–5 частей, прижмите ткани стерильным поршенем шприца объемом 3 или 5 мл, чтобы раздвинуть фрагменты селезенки и позволить клеткам пройти через проволочную сетку.
   3. Осторожно удалите эритроциты, суспендируя спленоциты в буфере для лизиса эритроцитов в соотношении 1:4 (1 мл буфера для лизиса в 3 мл PBS на одну селезенку) и инкубируя в течение 5 минут при комнатной температуре.
   4. Затем разбавляют 10 мкл клеточной суспензии раствором трипанового синего красителя для подсчета клеток с помощью гемоцитометра, а остальные клетки гранулируют центрифугированием при 350 х г в течение 7 мин.
3. Обогащение CD8 Т-клеток (день 0)
   1. Обогащайте CD8 Т-клетки путем отрицательного отбора с помощью набора для выделения CD8 Т-клеток мыши, следуя инструкциям производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения высокой чистоты всегда округляйте количество клеток в большую сторону при расчете объема добавляемого биотинилированного антитела (например, используйте объем реагентов, рекомендованный для 10⁸ клеток, для рассчитанных 9,1 x 10⁷ клеток).
   2. Суспензируйте клеточные гранулы в 400 мкл буфера и 100 мкл биотиново-антителенного коктейля на 1 x 10⁸ клеток, хорошо перемешайте и инкубируйте в течение 5 мин в холодильнике (4 °C) для связывания антител.
   3. Добавьте 300 мкл меченого буфера и 200 мкл микрогранул антибиотина на 1 x 10⁸ клеток, хорошо перемешайте и инкубируйте в течение 10 мин при 4 °C.
   4. В ожидании связывания микрогранул установите разделительную колонну на сепаратор. Промыть колонку, промыв 3 мл этикетировочного буфера.
   5. Пропустите 1000 μL смеси гранул/клеток через сетчатый фильтр 40 μм перед загрузкой на разделительную колонну для удаления клеточных агрегатов. Соберите проточный поток колонны в предварительно охлажденную пробирку объемом 15 мл.
   6. Вымойте колонку в соответствии с инструкцией производителя, собрав все стоки в одну трубку. Определите номер ячейки (аналогично шагу 3.2.4) и соберите методом центрифугирования при 350 x g в течение 5 минут. Промойте клетки путем ресуспендирования в 2 мл полной Т-клеточной среды (RPMI-1640, содержащей FCS, 2-меркаптоэтанол, rhIL-2 (200 Ед/мл), мышиного интерлейкина-7 (mIL-7, 0,5 нг/мл), ITS, 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновой кислоты (HEPES) и пенициллин-стрептомицина) и центрифугирования при 350 x g в течение 5 минут.
   7. Ресуспендируйте клетки в предварительно нагретой (37 °С) полной Т-клеточной среде в концентрации 0,25–0,5 х 10⁶/мл.

4. Активация Т-клеток (день с 0 по 2)

1. Добавьте 2 мл клеточной суспензии (0,25–0,5 x 10⁶/мл) в каждую покрытую лунку 24-луночного планшета, покрытого антителами CD3/CD28, начиная с этапа 3.1.2. Используйте вращательные движения, чтобы равномерно распределить ячейки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте ячейки вращательными движениями, чтобы равномерно распределить их и свести к минимуму эффект краев. Если клетки группируются вдоль края лунок, то скорость трансдукции и жизнеспособность клеток будут снижены.
2. В качестве контроля поместите такое же количество CD8 Т-клеток в одну лунку планшета без покрытия. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с помощью газового инкубатора с 10% содержанием_CO2 в течение 48 ч.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Через 48 часов активация может быть подтверждена с помощью микроскопа; активированные клетки будут крупнее, чем клетки, которые не сталкивались с антителами к CD3/CD28.

5. Трансдукция активированных CD8 Т-клеток (дни с 1 по 3)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует метод спин-трансдукции. Требуется центрифуга с поворотным ротором и адаптерами для тканевых планшетов, способная поддерживать внутреннюю температуру 37 °C. Чтобы обеспечить максимальную эффективность, в день трансдукции предварительно прогрейте центрифугу до 37 °C перед сбором вируса.

1. Приготовление пластин, покрытых фрагментами фибронектина человека (день 1 - день 2)
   1. В день 1 добавьте 0,5 мл фибронектина (50 мкг/мл в PBS) в лунки 24-луночного планшета и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, требуется две лунки, покрытые фибронектином, на одну пластину трансфицированных клеток Феникса.
   2. На 2-й день удалите раствор фибронектина и замените 1 мл 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин для «блокировки» неспецифических мест связывания.
   3. Промыть обработанные лунки 1 мл стерильного PBS. После удаления моющего раствора пластина готова к использованию; или могут быть запечатаны и храниться при температуре 4 °C до одной недели.
2. Сбор активированных CD8 Т-клеток (день 2)
   1. Соберите активированные CD8 Т-клетки, подсчитайте и рассчитайте жизнеспособность клеток с помощью трипанового синего или подходящего автоматизированного прибора.
   2. Соберите клетки центрифугированием и ресуспендируйте при концентрации 5 x 10⁶ жизнеспособных клеток/мл для трансдукции. Поддерживайте небольшую аликвоту клеток в культуре в полной среде Т-клеток в инкубаторе CO₂ для обеспечения контроля последующей сортировки трансдуцированных клеток флуоресцентными активируемыми клетками (шаг 6).
      Примечание: После активации в течение 48 ч общее количество клеток должно увеличиться примерно в 1,5 раза, и иметь жизнеспособность более 95%.
3. Трансдукция (День 2)
   1. Добавьте 100 мкл активированной суспензии клеток CD8 в лунку (0,5 x 10⁶ клеток) в пластину, покрытую фибронектином. Затем в каждую лунку добавьте по 1,5–2 мл вируссодержащей среды (с шага 2,6). Перемешайте вращательными движениями, чтобы равномерно распределить ячейки (рисунок 2).
   2. Поместите пластину в пластиковый пакет с застежкой-молнией и запечатайте (чтобы обеспечить вторичную защиту). Центрифуга при 2000 x g в течение 90 мин при 37 °C.
   3. Снимите пластину с центрифуги. В целях биологической безопасности шкаф осторожно снимают полиэтиленовый пакет и следят за тем, чтобы снаружи пластина не была загрязнена какой-либо средой.
   4. Затем перенесите планшет в специальный инкубатор с температурой 37 °C CO₂. Через 4 ч удалите по 1 мл среды из каждой лунки и замените 1 мл предварительно подогретой полной Т-клеточной среды. Установите на место пластину в инкубаторе CO₂.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте все среды из трансдуцированных клеток как инфекционные отходы.

Результаты

Рисунок 1: Схема ретровирусной конструкции CAR. CAR содержит целевой домен, полученный из Fab-фрагмента подходящего мышиного моноклонального антитела, и спейсер/мембранный якорный/сигнальный домен из мышиных CD28, CD137 и CD247. Синтетическая кДНК встраивается в ретровирусный экспрессирующий вектор pMIG-II. Показаны сайты эндонуклеазы рестрикции, используемые для генерации mAb287-CAR.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2-Меркаптоэтанол (50 мМ)	Gibco	21985-023	50 мкМ
5' ГОНОЧНАЯ ПЦР	Клонтех	634859
антитела к мышиному CD28	eBioscience	Тел.: 14-0281-86	Конечная концентрация при 1μг/мл
антитела к мышиному CD3e	eBioscience	145-2С11	Конечная концентрация при 1μг/мл
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ	BD Biosciences	No 554410 (Английский	Рабочая концентрация при 0,5 мкг/мл
БСА	сигма	А7030
Набор Maxi-Prep без эндо	Цягэн	No 12362
Гентамицин	Gibco	15750-060	Итоговая норма 50 мкг/мл.
Термоинактивированная ССК	Гиклон	SH30087.03	Итоговые 10% FCS
ГЕПЕС (100Х)	Gibco	15630-080 (Английский)	В 1 раз
Инсулин-трансферрин-селен-этаноламин (ITS 100x)	ТермоФишер	51500056	Конечная концентрация равна 1x
Липофектамин 2000	Инвитроген	11668019
Колонны LS	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-042-401
Разделительный буфер MACS	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-091-221
Набор для выделения Т-клеток CD8a+ мыши	Милетеньи Биотек Инк	Тел.: 130-104-075
Набор для выделения Т-клеток CD8a+ мыши	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-104-075
Opti-MEM средний	ТермоФишер	31985070
Пенициллин-стрептомицин (5000 ед/мл)	ТермоФишер	15070063	50 ед/мл
Элементы Феникс-ЭКО	АТКС	ЦРЛ-3214
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Gibco	10010-023
pMIG II	Адджен	No 52107
pMSCV-IRES-GFP II	Адджен	No 52107
Буфер для лизиса эритроцитов	сигма	Р7767
РетроНектин	Такара	Т100А	Рабочая концентрация при 50 мкг/мл в PBS
rhIL-2 (исходная концентрация 105 МЕ/мкл)	Пепротех	200-02	Конечная концентрация при 200 МЕ/мл
рмИл-7 (концентрация исходного материала 50нг/мкл)	НИОКР	407-МЛ-005	Конечная концентрация 0,5 нг/мл
РПМИ-1640	Gibco	11875-093
Стерильные клеточные фильтры	Научный центр Фишера	Тел.: 22-363-548
Трипл	Gibco	12605-028

) гг.