1. Микроинъекция эмбрионов рыбок данио с бактериями и фаговым коктейлем
ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения системной инфекции у эмбриона должно быть кровообращение, которое обычно начинается после 26 hpf.
- После 26 hpf дехорионатные эмбрионы раствором проназы готовят путем растворения порошка проназы в среде Е3 в концентрации 2 мг/мл. Аккуратно пипеткой зародыши разбить хорион. Выбросьте проназу / Е3 и несколько раз промойте посуду свежим Е3, чтобы удалить всю проназу.
- Обезболите эмбрионы данио-рерио в среде Е3, содержащей трикаин, примерно за 5 минут до инъекций.
- Введите пипеткой обезболиваемые эмбрионы в дорожку, подготовленную на шаге 1. Используйте тонкий наконечник для загрузки гелем, чтобы выровнять эмбрионы в боковом положении.
- Загрузите в иглу для микроинъекций примерно 5 мкл препарата P. aeruginosa.
- Введите иглу дорсально в начальную точку протока Кювье, где она начинает распространяться по желточному мешку. Введите объем 1-3 нл и убедитесь, что объем расширяется непосредственно внутри протока и попадает в кровоток.
- Примерно после каждых 50 инъекций эмбрионов вводите каплю бактерий в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл со 100 мкл стерильного PBS, чтобы проверить, остается ли объем инъекции прежним. Нанесите инокулюм на агар LB (см. Таблицу 1) при температуре 37 °C в течение ночи для оценки КОЕ.
- Перенесите микроинъекционные эмбрионы в две чистые чашки Петри со свежей средой Е3 + ПТУ (Таблица 1) и инкубируйте их при температуре 28 °C.
- В два выбранных временных момента: через 30 минут или через 3 часа после бактериальной инъекции, достаньте из инкубатора одну из чашек Петри с бактериально введенными эмбрионами и выровняйте их по траектории, как описано в 6.3 для инъекции фагового коктейля.
- Загрузите иглу для микроинъекций примерно 5 мкл фагового коктейля (смесь четырех фагов, инфицирующих штамм PAO1) тонким гелевым наконечником и закрепите его на микроинъекторе.
- Введите фаговый коктейль в проток Кювье эмбрионов, ранее введенных бактериями.
- Перенесите микроинъекционные эмбрионы в две чистые чашки Петри со свежей средой Е3 + PTU и инкубируйте их при температуре 28 °C.
Таблица 1: Приготовление растворов
| Решения | подготовка |
| Обезболивающий стоковый раствор 25X | 4 мг/мл трикаина в дистиллированном H2O. |
| Обезболивающий рабочий раствор 1X | развести в дистиллированном H2O стоковый раствор трикаина 25X до достижения концентрации 1X (0,16 мг/мл) трикаина дистиллированного H2O. |
| CsCl d=1.3 | 20,49 г в 50 мл TN |
| CsCl d=1.4 | 20,28 г в 50 мл ТН |
| CsCl d=1.5 | 34,13 г в 50 мл TN |
| CsCl d=1.6 | 41,2 г в 50 мл TN |
| Среда для эмбрионов рыбок данио Е3 | 1 л 1 из Е3 (разбавить 50Х бульон дистиллированным H2O) + 200 мкл 0,05% метилового синего. Храните в RT. |
| Е3 раствор для эмбрионов среднего размера (50X) | 73,0 г NaCl, 3,15 г KCl, 9,15 г CaCl2 и 9,95 г MgSO4 в 5 л дистиллированной H2O. Храните в RT. |
| ЛБ агар | 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 10 г/л агара |
| LB бульон | на 1 л: 950 мл H2O, 10 г триптона, 10 г NaCl, 5 г дрожжевого экстракта |
| ПБСТ | PBS 1X + Triton X 1% |
| Физиологическое решение | 0,9% NaCl |
| Стоковый раствор для блокирования пигментации 10X | 0,3 мг/мл порошка фенилтиомочевины (ПТУ) в среде эмбриона Е3 для эмбриона данио-рерио |
| Стоковый раствор проназы 5X | Порошок проназы 5 мг/мл в среде для эмбрионов рыбок рерио Е3 |
| Буфер TN | 10 мМ Tris HCl pH 8,0, 150 мМ NaCl |
