Инъекция обогащенной тромбоцитами плазмы в рассеченное ахиллово сухожилие крысы

Аннотация

Источник: Greimers, L., et al. Влияние аллогенной обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) на процесс заживления рассеченных ахилловых сухожилий крыс: методологическое описание. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует технику введения обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) в разрезанное ахиллово сухожилие крыс. Небольшой сегмент вырезается из ахиллова сухожилия крысы-реципиента, участок зашивается, и крысе дают восстановиться. Одновременно с этим у крысы-донора собирают цельную кровь и центрифугируют для получения PRP, которую затем активируют и вводят в ушивное место крысы-реципиента для стимуляции восстановления сухожилия.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовка животных

1. Используйте 132 2-месячных самца крыс породы Sprague-Dawley весом 320-450 г (120 крыс для экспериментов и 12 крыс для забора крови, рис. 1). Пятнадцати крыс для каждой группы было достаточно для степени 0,8 (80% шанс найти статистическую значимость при наличии указанного эффекта).
2. Содержать всех крыс в классических клетках в условиях изоляции в обычном помещении, оборудованном пеленальным станком. Начните разведение в стойке IVC (индивидуально вентилируемая клетка), при этом специально приобретаются крысы без специфических патогенов.
3. Используйте следующие условия содержания: температурный режим от 19-24 °С; относительная влажность: 40-60%; вентиляция: частота обновления воздуха: 10-15 в час; цикл света/темноты: 12 ч-12 ч.
4. Простерилизуйте все оборудование для клеток и используйте облученную подстилку. Систематически реализуйте обогащение клеток, помещая внутрь клеток стерильные картонные лотки и полотенца.
5. Разрешить доступ в зону в ограниченных условиях: новый лабораторный халат, маску, перчатки, обувь и чепчик для волос на входе.
6. Ежегодно проводите мониторинг состояния здоровья дозорных животных, содержащихся на грязной подстилке, в соответствии с рекомендациями Felasa для обычных помещений. Содержите от четырех до пяти животных в клетке с соответствующей облученной диетой и обеспечьте ее подкисленной водой в неограниченном количестве. Ежедневный мониторинг.
7. Крыс, отобранных для хирургического вмешательства, переводят в операционные за 2 ч до операции.

2. Хирургическая процедура

1. Подготовьте хирургические инструменты: тонкие ножницы, зажим, два кровоостанавливающих зажима и иглодержатель. Во время всех процедур надевайте перчатки, маску, капюшон и лабораторный халат.
2. Случайным образом разделите крыс на две группы (PRP и физиологический раствор).
3. Вытащите крысу из клетки и взвесьте ее. Используйте пронумерованные ушные бирки для идентификации крыс. Чтобы избежать высыхания глаз, капляйте капли воды на роговицу.
4. Обезболивайте крысу внутрибрюшинно ксилазином (10 мг/кг массы тела) и кетамином (80 мг/кг массы тела). Поместите животных под кардиореспираторный мониторинг для подтверждения анестезии и проверки глазных рефлексов.
5. Введите 50 мкл бупренорфина подкожно (0,01-0,05 мг/кг каждые 8-12 ч) в область шеи в качестве обезболивающего.
6. Выбрейте левую заднюю конечность электробритвой, продезинфицируйте ее 3 чередующимися скрабами раствора изобетадина/спирта (разбавленного 1:10) и положите крысу на теплую подушку (20 °C) под препарирующим микроскопом. Положите крысу на боковое пролежни так, чтобы оперируемая нога находилась в верхнем положении. Зажмите лапу хирургическими щипцами.
7. С помощью ножниц сделайте небольшой боковой разрез (20-25 мм) на коже вокруг левого ахиллова сухожилия и рассеките фасцию тонкими ножницами, чтобы обнажить комплекс ахиллова сухожилия (Рисунок 2а).
8. Удалите подошвенное сухожилие ножницами (рисунок 2b).
9. Разрежьте ахиллово сухожилие поперечно на 5 мм проксимальнее его пяточного отверстия и удалите часть длиной 5 мм с помощью ножниц. Не накладывайте швы на сухожилие (Рисунок 2c, 2d).
10. Сшить фасцию и кожу рассасывающейся нитью, сделав оверджет шов (непрерывный шов). Монофиламентные швы также могут предотвратить отток из кожи в хирургический разрез.
11. Поместите крысу под нагревательную лампу до тех пор, пока она не придет в себя, а затем поместите крысу обратно в клетку (58 x 38 см) (примечание bene: иммобилизация не накладывается).

3. Подготовка к ОТР

1. Обезболивайте крыс-доноров ксилазином (10 мг/кг массы тела) и кетамином (80 мг/кг массы тела) путем внутрибрюшинного введения. Инъекция PRP проводится через 2 ч после операции без применения каких-либо реанестезиологических средств.
2. Введите 50 мкл бупренорфина подкожно в качестве обезболивающего.
3. Соберите цельную кровь (20 мл на крысу, окончательное кровотечение) путем пункции сердца в стерильные пробирки, содержащие 3,2% буферизованного цитрата натрия (0,109 М, антикоагулянт). Затем усыпьте крысу путем внутрисердечной инъекции.
4. Для получения PRP необходимо центрифугировать кровь в течение 10 мин при 150 x g и комнатной температуре. Эта начальная стадия низкоскоростного центрифугирования дает две отдельные фазы: нижняя фаза, состоящая из эритроцитов (эритроцитов), на долю которых приходится около 80-90% от общего объема, и верхняя фаза, состоящая из обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) (обычно 10-20% образца крови).
5. Соберите PRP (верхнюю фазу) во вторичную пластиковую пробирку с помощью пластиковой переводной пипетки. Поскольку граница раздела между PRP и эритроцитами очень слабая, не делайте пипетку слишком близко к границе раздела. При правильном обращении контаминирующие эритроциты в PRP должны быть ниже 0,05 x 10³ клеток/мкл. Выбросьте оставшуюся нижнюю фазу и первичную пробирку для сбора крови.
6. Определите объем собранного PRP и измерьте количество тромбоцитов на гематологическом анализаторе. Эти значения необходимы для расчетов по корректировке концентрации тромбоцитов на следующем этапе. Подсчет клеток крови также полезен для оценки потенциального загрязнения эритроцитами и лейкоцитами. Концентрация тромбоцитов в PRP на этой стадии обычно составляет 1 – 1,5 x 10⁶/мкл.
7. Выполните второе центрифугирование PRP в течение 10 минут при 1000 x g и комнатной температуре. Эта высокоскоростная стадия центрифугирования позволяет получить рыхлую тромбоцитарную гранулу и надосадочную жидкость аутологичной бедной тромбоцитами плазмы (PPP). Используя значения, определенные на шаге 3.6, рассчитайте объем надосадочной жидкости, который должен быть отброшен для концентрации PRP, и достигните конечной концентрации 2,5 x 10⁶/μл.
8. Аккуратно соберите надосадочную жидкость (PPP) во вторичную пластиковую пробирку с помощью пластиковой переводной пипетки, оставив около двух третей конечного объема, рассчитанного на шаге 3.7. Поскольку гранулы рассыпаются, значительное количество тромбоцитов теряется при выбросе СЗР, что потенциально снижает желаемую концентрацию.
9. Осторожно ресуспендируйте тромбоцитарную гранулу с оставшимся надосадочным веществом путем осторожного повторного пипетирования. Измерьте количество тромбоцитов на этом концентрированном PRP. При необходимости добавьте соответствующий объем аутологичного СЗР для достижения конечной целевой концентрации.
   заметка: Используйте PRP в течение 3 часов после приготовления.
10. Добавьте 50 мкл CaCl₂ (11 мЭкв 10 мл) на мл PRP для активации тромбоцитов.
11. Введите 50 μL свежего PRP или физиологического раствора с помощью иглы 21G непосредственно в место наложения швов примерно через 1 ч после приготовления. В течение этого времени держите PRP при комнатной температуре.
12. Внимательно следите за функциональным восстановлением крыс в течение нескольких дней после операции и до удаления ахиллова сухожилия.

Результаты

Рисунок 1: Экспериментальный дизайн исследования.

Рисунок 2: Хирургическая процедура.

(a) Комплекс сухожилий после удаления окружающей фасции.

(b) Удаление подошвенного су...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ксилазин (Ксил-М)	ВМД	никакой	анестезирующий
Кетамин (Jétamine 1000 CEVA)	CEVA Santé Animale	никакой	анестезирующий
Бупренорфин (Vetergésic Multidosis)	АЛСТОУ	никакой	болеутоляющее средство
изо-бетадин	МЕДА-Фарма	никакой	Дезинфицирующее средство
Резорбируемая пряжа Vicryl 6/0	Джонсон и Джонсон
Нембутал	CEVA Santé Animale	никакой	анестезирующий
Параформальдегид	Сигма-Олдрич	П6148	Сохраняет структуру ткани
Изопропанол 100%	ВВР	2,09,22,364
Этанол 95%	ВВР	2,08,23,362
ксилол	ВВР	No 28973.363
парафин	ВВР	LEIC3950.1006
Гематоксилин	Многородность	1.15938.0025	краситель
эозин	Многородность	1.15935.0100	краситель
Юкитт	Сигма-Олдрич	No 3989	Монтажная среда
CaCl2

Кабель