$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Синтез полимера поли(бета-аминоэфиров) (pBAE) с концевыми олигопептидами (OM-pBAE)
- Полимеризация C6-pBAE
- Добавьте 5-амино-1-пентанол (38 ммоль; MW = 103,16 Да) 1-гексиламин (38 ммоль; MW = 101,19 Да) в стеклянную колбу с круглым дном (100 мл). Затем добавьте 1,4-диоксидиал бутандиола (82 ммоль; MW = 198,22 Да).
- Предварительно нагрейте ванну с силиконовым маслом до 90 °C, поместите колбу с круглым дном в масляную баню и перемешайте смесь с помощью магнитной мешалки в течение ночи (~18 часов). Затем достаньте продукт из колбы с круглым дном и поместите его в морозильную камеру при температуре -20 °C.
заметка: Изделие находится в виде липкого порошка и достается из колбы с помощью шпателя. Необходимо валидировать структуру полученного полимера с помощью 1H-ЯМР. Спектры ЯМР регистрировали в приборе с частотой 400 МГц (см. Таблицу материалов) с использованием хлороформа-d и D2O в качестве растворителей. Отбирали около 10 мг каждого поли(β-аминоэфира) и растворяли в 1 мл дейтерированного растворителя.
- Реакция с пептидами с получением OM-pBAE
- Добавьте 25 мл 0,1 М HCl к выбранным пептидам, например, пептиду Cys-His-His-His с трифторуксусной кислотой (TFA, 200 мг), в предварительно взвешенную центрифужную пробирку объемом 50 мл, которая может выдержать сублимационную сушку и вручную перемешать в течение ночи для получения прозрачного раствора.
- Заморозьте раствор при температуре -80 °C в течение 1 ч и обсушите полученный пептид гидрохлорид.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте, соответствует ли окончательный вес теоретическому значению.
- Сделайте раствор C6-pBAE (0,031 ммоль) в диметилсульфоксиде. Также вносят раствор пептида гидрохлорида (0,078 ммоль) в диметилсульфоксиде.
- Смешайте два раствора в пробирке с завинчивающейся крышкой и закрутите крышку. Раствор смеси перемешать на водяной бане с контролируемой температурой 25 °C в течение 20 ч с помощью магнитной мешалки.
- Добавьте смесь к диэтиловому эфиру/ацетону 7:3 (v/v). Полученную суспензию центрифугируют при температуре 25 000 x g при 4 °C для удаления растворителя. Затем дважды промойте твердое вещество диэтиловым эфиром/ацетоном 7:3 (v/v). Затем просушите изделие под вакуумом (<0,2 атм).
- Приготовьте раствор 100 мг/мл средства в диметилсульфоксиде. Полученный продукт получил название C6-пептид-pBAE. Необходимо валидировать структуру полученного полимера с помощью 1H-ЯМР для подтверждения исчезновения олефиновых сигналов, связанных с концевыми акрилатами. Если полимер не используется, его можно заморозить при температуре -20 °C.
2. Образование полиплексов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны выполняться в кондиционированном помещении для поддержания постоянной температуры.
- Разморозьте полимеры С6-пептид-pBAE и закрутите раствор.
- Пипеткой перемешайте полимерную смесь вверх и вниз и приготовьте раствор 12,5 мМ (V1) в ацетате натрия (NaAc). Затем перемешайте смесь и подождите 10 минут.
- Приготовьте матричную рибонуклеиновую кислоту (мРНК) в концентрации 0,5 мг/мл и перемешайте пипеткой (V2).
заметка: Крайне важно избегать вортекса мРНК.
- Вихревую полимерную смесь при конечной концентрации для получения однородного раствора между полимерным материалом в диметилсульфоксиде (ДМСО) и ацетатным буфером.
заметка: Конечная концентрация полимера зависит от выбранного соотношения N/P (азотно-фосфатные группы). Соотношение N/P зависит от каждой конкретной мРНК, которая будет использоваться. Например, для инкапсуляции зеленого зеленого флуоресцентного белка (eGFP) использовалось соотношение 25:1, как сообщалось ранее.
- Смешайте раствор генетического материала и раствор C6-пептидepBAE (в 25 раз больше концентрации мРНК) в соотношении 1:1 (Vi = V1 + V2).
заметка: C6-пептид-pBAE загружается в микроцентрифужную пробирку, куда мРНК добавляется путем пипетирования вверх и вниз для смешивания. После приготовления полиплекс, нуклеиновая кислота и концентрации С6-пептид-pBAE разбавляют наполовину.
- Инкубировать при температуре 25 °C в течение 30 минут в термоблоке. Осадите водой, не содержащей РНКазы в соотношении 1:2, добавив образец в предварительно загруженную микроцентрифужную пробирку с водой.
- Включите вспомогательные вещества. Добавьте тот же объем, что и смесь мРНК и pBAE (Vi) в 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновую кислоту (HEPES) 20 мМ и сахарозу 4% путем пипетирования вверх и вниз. К этому моменту образец разбавлен в 3 раза.
3. Лиофилизация полиплексов
- Мгновенно заморозьте при -80 °C морозильную камеру предыдущего полиплексного раствора в течение 1 ч.
- Выполните первичную сушку, выполнив следующие шаги: (1) 1 ч при -60 °C и 0,001 гПа; (2) 1 ч при -40°С и 0,0001 гПа; (3) 4 ч при -20°C и 0,0001 гПа; (4) 12 ч при 5 °C и 0,0001 гПа.
- Хранить при температуре -20 °C немедленно, чтобы избежать регидратации, до использования.