Очистка самоорганизующихся белковых наночастиц с помощью аффинной хроматографии

Аннотация

Источник: Karch, C. P. et al., Производство самоорганизующихся белковых наночастиц, экспрессируемых E. coli, для вакцин, требующих тримерной презентации эпитопов.J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует очистку самоорганизующихся белковых наночастиц или SAPN, помеченных гистидином, с помощью аффинной жидкостной хроматографии. Полученные очищенные фракции SAPN пригодны для разработки вакцин и имеют перспективы для потенциального иммунотерапевтического применения.

Протокол

1. Экспрессия ядра самоорганизующихся белковых наночастиц, содержащего белок из шести спиралей (SHB-SAPN) в E. coli BL21(DE3)

1. Смешайте 95 мл компонента А и 5 мл компонента Б среды в колбе Эрленмейера из стерильного стекла объемом 2 л в соответствии с инструкцией производителя (см. Таблицу материалов). Добавьте ампициллин до конечной концентрации 100 мкг/мл.
2. Инокулируйте среду кишечной палочкой из ранее созданной глицериновой исходной культуры. Инкубировать культуру при 30 °C с встряхиванием со скоростью 200 оборотов в минуту (об/мин) в течение 48 ч.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Использованный запас E. coli BL21 (DE3) содержал устойчивый к ампициллину вектор экспрессии с геном SHB-SAPN. Несмотря на то, что общий протокол среды рекомендует 24 часа инкубации при 37 °C, 48 часов инкубации при 30 °C дают более высокий выход для SHB-SAPN.
3. Переложите культуру в две конические пробирки объемом 50 мл. Центрифугируйте пробирки при давлении 4 000 x g в течение 10 минут с помощью ротора с фиксированным углом наклона при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и сохраните гранулу для сбора урожая.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы могут быть обработаны сразу или заморожены при температуре -80 °C до использования.

2. Лизис E. coli BL21(DE3) методом ультразвука

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте непирогенную пластиковую посуду и стеклянную посуду, запеченную при температуре 250 °C, в течение как минимум 30 мин. Трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP) в качестве восстановителя разрывает дисульфидные связи внутри и между белками. TCEP необходим для буферов во время этого протокола, если отображаемый антиген содержит S-S связи. Только для ядра SHB-SAPN присутствие TCEP в буферах не является существенным.

1. Приготовьте буфер без имидазола (8 М мочевины, 50 мМ натрия фосфата моноосновного, 20 мМ трис основания, 5 мМ TCEP) pH 8,0 (с учетом 5 Н гидроксида натрия, NaOH) и отфильтруйте его с помощью вакуумной бутылочной фильтрующей установки 0,22 мкм.
2. Ресуспендируйте гранулированные клетки (начиная с шага 1.3) с 40 мл буфера, не содержащего имидазола, в одной конической пробирке объемом 50 мл. Ультразвуком обрабатывают ресуспензированные клетки зондом на льду в течение 5 мин (4 с ультразвуковой обработки, 6 с покоя) с выходной мощностью ультразвука 150 Вт.
3. Центрифугируйте клеточный лизат (40 мл) при 29 000 x g при 4 °C в течение 25 мин в роторе с фиксированным углом наклона для получения осветленной надосадочной жидкости. Переложите надосадочную жидкость в стерильную колбу объемом 150 мл и выбросьте гранулу. Разведите надосадочную жидкость до 100 мл с использованием буфера, не содержащего имидазола (далее в протоколе именуемого «образцом»).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап разбавления необходим для предотвращения слишком высокого давления в системе быстрой жидкостной хроматографии (FPLC) во время нагрузки лизата на колонку.

3. Очистка белка с помощью His-колонки

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был выполнен с использованием инструмента FPLC, но его можно адаптировать к гравитационному потоку.

1. Приготовьте следующие буферы и отфильтруйте их с помощью фильтрующей установки для вакуумных бутылок 0,22 мкм: (i) буфер без имидазола «Буфер А» (8 М мочевины, 50 мМ натрия фосфата моноосновного, 20 мМ трис основание, 5 мМ TCEP) pH 8,0; (ii) 500 мМ имидазола буфер "Буфер В" (8 М мочевины, 50 мМ натрия фосфата моноосновного, 20 мМ трис-основание, 5 мМ TCEP, 500 мМ имидазола) pH 8,0; и (iii) промывка изопропанола (20 мМ Трис, 60% изопропанола) pH 8,0,
   ПРИМЕЧАНИЕ: pH для каждого буфера регулировался с помощью 5 Н NaOH.
2. Уравновесьте столбец His.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для производства в лабораторных масштабах в этом протоколе используется предварительно упакованная His-колонка объемом 5 мл, но можно использовать любую колонку большего размера.
   1. Откройте программное обеспечение FPLC и нажмите на опцию «Новый метод». Он сразу же откроется в меню настроек метода. В выпадающем меню для положения столбца выберите порт C1 3.
   2. В раскрывающемся меню Показано по технике выберите сходство. В выпадающем меню Тип столбца выберите другие, Histrap HP, 5 мл. Объем колонны и напорные коробки будут автоматически установлены на соответствующие значения.
   3. Нажмите на кнопку «Контур метода». Перетащите следующие кнопки из всплывающего меню библиотеки фаз: «Балансировка», «Нанесение образца», «Промывка столбца» и «Элюирование» рядом со стрелкой в указанном порядке. Закройте меню Библиотека фаз.
   4. Нажмите на кнопку уравновешивания. Значения, перечисленные в таблице, должны быть «начальный буфер B» (4%), «конечный буфер B» (4%) и «объем (CV)» 5.
   5. Нажмите на поле «Пример приложения». В окне загрузки образцов нажмите переключатель Inject sample on column with sample pump. Убедитесь, что флажок рядом с настройками Использовать расход из настроек метода установлен в боксе для впрыска образца с помощью системного насоса. Рядом с окошком громкости в правой части экрана измените значение на 20 мл.
   6. Нажмите на кнопку «Промывка колонны». Значения, перечисленные в таблице, должны быть «начальный буфер B» (4%), «конечный буфер B» (4%) и «объем (CV)» 5. Рядом со схемой сбора дробей снимите флажок Включить.
   7. Нажмите на кнопку элюирования. В таблице должны быть перечислены следующие значения: "начальный буфер B" 0%, "конечный буфер B" 100% и "объем (CV)" 5. Рядом со схемой сбора дробей нажмите на поле «Включить». Снимите флажок Использовать размер дроби в настройках метода и установите размер дроби на 4 мл в поле для заполнения ниже.
   8. Нажмите кнопку «Сохранить как» в верхней части программного обеспечения. Назовите файл "equilibration".
   9. Подключите предварительно упакованную His-колонку объемом 5 мл к порту соответствующей колонки 3 на FPLC. Трубки насоса А и насоса В, а также трубки насоса для отбора проб должны быть помещены в отфильтрованную деионизированную воду с температурой 0,22 мкм. Запустите программу уравновешивания.
   10. Поместите насос А и насос В, а также трубку насоса для отбора проб в буфер, не содержащий имидазол (буфер А), и снова запустите протокол балансировки.
3. Привяжите образец к колонке и очистите белок.
   1. Откройте программное обеспечение FPLC и нажмите на опцию «Новый метод». Он сразу же откроется в меню настроек метода. В раскрывающемся меню для столбца выберите порт C1 3. В ниспадающем меню Показано по технике выберите сходство. В выпадающем меню типа столбца выберите другие, Histrap HP, 5 мл. Объем колонны и напорные блоки будут автоматически установлены на соответствующие значения.
   2. Нажмите на кнопку «Контур метода». Перетащите кнопки из всплывающего меню библиотеки фаз: уравновешивание, применение образца, промывка столбца (Wash 1), промывка столбца (Wash 2), промывка столбца (Wash 3) и Elution рядом со стрелкой именно в указанном порядке. Закройте меню Библиотека фаз.
   3. Нажмите на кнопку «Равновесие». Значения, перечисленные в таблице, должны быть «начальный буфер B» 4%, «конечный буфер B» 4% и «объем (CV)» 5.
   4. Нажмите на поле «Пример приложения». В окне загрузки образцов нажмите переключатель для выбораобразца I nject на столбце с насосом для отбора проб. Убедитесь, что флажок рядом с настройками Использовать расход из метода установлен в окне впрыска образца с системным насосом.
   5. Рядом с окошком громкости в правой части экрана измените значение на 100 мл. Рядом со схемой сбора дробей нажмите кнопку Включить. Снимите флажок Использовать размер дроби в окне настроек метода, а затем измените размер дроби на 4 мл.
   6. Нажмите на первую колонку кнопку промывки (Wash 1). Значения, перечисленные в таблице, должны быть «начальный буфер B» 4%, «конечный буфер B» 4% и «объем (CV)» 10. Рядом со схемой сбора дробей нажмите на поле Включить. Снимите флажок Использовать размер дроби в настройках метода, а затем измените размер дроби на 4 мл.
   7. Нажмите на вторую колонку кнопку промывки (Wash 2). В таблице должны быть перечислены следующие значения: "начальный буфер B" 0%, "конечный буфер B" 0% и "объем (CV)" 5. Рядом со схемой сбора дробей нажмите на поле Включить. Снимите флажок Использовать размер дроби в настройках метода, а затем измените размер дроби на 4 мл.
   8. Нажмите на кнопку промывки в третьей колонке (Wash 3). В таблице должны быть перечислены следующие значения: "начальный буфер B" 0%, "конечный буфер B" 0% и "объем (CV)" 5. Рядом со схемой сбора дробей нажмите кнопку Включить. Снимите флажок Использовать размер дроби в окне настроек метода, а затем измените размер дроби на 4 мл.
   9. Нажмите на кнопку «Элюция». В таблице справа щелкните перечисленную информацию и в появившемся меню выберите шаг Удалить. Дважды перетащите кнопку изократического градиента на таблицу, чтобы осталось две записи.
   10. Значение для первой записи должно выглядеть следующим образом: "начальный буфер B" 30%, "конечный буфер B" 30% и "Объем (CV)" 10. Значение для второй записи должно выглядеть следующим образом: "начальный буфер B" 100%, "конечный буфер B" 100% и "объем (CV)" 10. Рядом со схемой сбора дробей нажмите кнопку Включить. Установите флажок рядом с пунктом Использовать размер дроби в настройках метода.
   11. Нажмите кнопку «Сохранить» в верхней части программного обеспечения. Назовите файл "purification." Насос А с трубкой FPLC следует поместить в буфер для промывки, не содержащий имидазол, а трубку насоса B - в буфер с содержанием имидазола 500 мМ. Трубка насоса для отбора проб должна быть помещена в образец объемом 100 мл.
   12. Запустите программу «очищение» и дождитесь того времени, когда понадобится 60% изопропанол (Wash 2). Поставить программу на паузу; переместите насос А из промывки, не содержащей имидазола, в промывку с 60% изопропанолом. Перезапустите программу.
   13. После завершения этапа введения изопропанола снова приостановите программу и перейдите к закачке трубки А обратно в буфер для промывки, не содержащий имидазола. Перезапустите программу очистки (остальная часть прогона автоматизирована).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2-пропанол	рыбак	BP26181	4 л
Ампициллин	рыбак	БП1760-25	25 г
Corning Одноразовые вакуумные фильтры/системы хранения	рыбак	Тел.: 09-761-108	Разнообразие размеров
GE Healthcare 5 мл HisTrap HP Расфасованные колонны	GE HealthCare	Тел.: 45-000-325	5 упаковка
глицерин	рыбак	БП229-4	4 л
Имидазол	рыбак	О3196-500	500 г
Волшебная среда для экспрессии E. coli	ТермоФишер	К6803	1 л
Стерильный шприц MilliporeSigma Millex 0,22 мм Фильтры	Многородность	SLGV033RB	Упаковка 250
One Shot BL21 Star (DE3) Химически компетентная кишечная палочка	ТермоФишер	C601003	20 флаконов
Натрия фосфат одноосновной	рыбак	БП329-500	500 г
База Трис	рыбак	БП152-1	1 кг
мочевина	рыбак	БП169-500	2,5 кг
оборудование
Fiberlite F14-14 x 50cy Ротор с фиксированным углом наклона	ТермоФишер	096-145075 (Английский	ротор
Хроматографическая система NGC Quest 10	БиоРад	7880001	FPLC для очистки белка
Сонифер 450	Брэнсон	также известен как 096-145075	Ультразвуковой аппарат

)