$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB. Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Конструирование гуманизированных мышей, сконструированных с помощью химерного антигенного рецептора CD4
- Обработка фетального тимуса и выделение CD34+ ГСК из печени плода
- Обработка тимуса
- Аккуратно промойте тимус в фосфатно-солевом буфере (PBS), pH 7,4, в конической пробирке объемом 15 мл. Повторите шаг стирки 3 - 4 раза.
- Добавьте 7 мл среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) + пенициллин/стрептомицин (Pen/streprep). Сцедите все в стерильную чашку Петри диаметром 100 мм.
- С помощью скальпелей разрежьте тимус на небольшие кусочки размером около 1 мм2 . Поместите каждый кусочек тимуса в одну лунку на 96-луночной пластине. Используйте изогнутые тупые щипцы при переносе кусочков тимуса на 96-луночный планшет.
- Добавьте небольшое количество среды (100 - 200 μл) во все лунки, чтобы ткань не пересыхала. Визуализируйте под микроскопом (тимины имеют доли и должны выглядеть как мешки с клетками).
заметка: Отбросьте любые вещи, которые выглядят сомнительно; Там часто присутствует соединительная ткань, и ее не следует имплантировать.
- Удалите подтвержденные кусочки тимуса и поместите их все в колбу для клеточных культур T25. Добавьте 7 мл среды RPMI с добавлением 10% FBS и 450 мкг/мл пиперациллина/тазобактама и амфотерицина В. Осторожно раскачайте колбу для перемешивания. Заквашивайте колбу в течение ночи при температуре 37 ºC/5% CO2,
заметка: Этот шаг необходим для предотвращения бактериального загрязнения тканей.
- (Необязательный шаг) Заморозьте тимус для дальнейшего использования. Уравновесьте порции 90% сыворотки АВ человека с 10% диметилсульфоксидом (ДМСО) в течение 10 минут. Заморозьте их при температуре от 1 ºC/мин до -50 ºC, затем быстро охладите до -150 ºC. Когда будете готовы к оттаиванию, быстро оттайте на водяной бане при температуре 37 ºC и аккуратно промойте 3 раза в комплектном фильтрующем материале RPMI без ДМСО.
- Переработка печени
- Аккуратно промойте печень в PBS в конической трубке объемом 50 мл. Повторите шаг стирки 3 - 4 раза.
- Добавьте 10 мл модифицированной среды Dulbecco's Media (IMDM) от Iscove в коническую пробирку объемом 50 мл. Сцедите все в стерильную чашку Петри диаметром 100 мм.
- Гомогенизируйте ткань печени с помощью двух скальпелей. Печень нарезать небольшими кусочками примерно 3мм2. Вырежьте и выбросьте любую белую соединительную ткань.
- С помощью шприца объемом 10 мл с тупой иглой 16-го калибра заберите кусочки печени и среды. Затем переложите в коническую пробирку объемом 50 мл.
- Повторно суспендируйте среду и тканевую суспензию и изгните еще 5-7 раз для полной гомогенизации ткани.
- Приготовьте 10 мл среды IMDM с добавлением ферментов: 500 Ед/мл коллагеназы, 2400 Ед/мл гиалуронидазы и 300 Ед/мл ДНКазы, а также 450 мкг/мл пиперациллина/тазобактама и амфотерицина В. Отфильтруйте среду через фильтр 0,22 мкм, затем добавьте среду в печеночную суспензию.
- Закройте коническую трубку объемом 50 мл с печеночной суспензией и плотно закройте самогерметизирующейся пленкой, такой как Parafilm, чтобы предотвратить утечки. Вращать в трубчатом ротаторе в инкубаторе при температуре 37 ºC в течение 90 мин.
- Отфильтруйте расщепленную клеточную суспензию через клеточное ситечко 100 мкм в свежую пробирку объемом 50 мл.
заметка: Добавьте PBS в суспензию для увеличения общего объема до 50 мл. Разделите его на две пробирки по 50 мл, каждая из которых содержит 25 мл клеточной суспензии.
- Медленно и аккуратно подложите клетки в каждой пробирке центрифугирующей средой плотностью 10 мл (например, Ficoll). Вращайтесь со скоростью 1 200 x g в течение 20 минут без тормоза. Примечание: все центрифугирования, упомянутые в этом протоколе, проводятся при комнатной температуре (25 ºC).
- Осторожно удалите интерфейс (т.е. оболочку) из каждой пробирки и переложите в две отдельные пробирки по 50 мл. Доведите объем каждой пробирки интерфейса до 50 мл с помощью PBS. Вращайте при 300 x g в течение 7 - 10 минут. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость.
- Соедините две гранулы. Умыться еще три раза 50 мл PBS, содержащим 2% FBS. Вращайте при давлении 300 x g в течение 7 - 10 минут каждый, осторожно отсасывая надосадочную жидкость.
- Ресуспендировать гранулу в среде 50 мл RPMI + 10% FBS. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, прежде чем приступать к сортировке клеток.
- Согласно протоколу производителя, немедленно отсортируйте CD34+ клетки с помощью набора для сортировки CD34 (например, микрогранулы CD34).
заметка: В качестве альтернативы, клетки могут быть культивированы в течение ночи в среде RPMI + 10% FBS при концентрации 1 млн/мл.
- Сохраните доли CD34+ и CD34-.
заметка: На этом этапе CD34+ и CD34-клетки могут быть заморожены с помощью замораживающей среды Bambanker или другой замораживающей среды. Заморозьте 1 мл 4 - 6 x 106 CD34+ клеток в пробирке и заморозьте 1 мл 40 - 60 x 106 CD34-клеток в пробирке.
- Трансдукция CD34+ клеток
- Рассчитайте количество трансдукционных лунок, необходимых для 6-луночного планшета для культивирования тканей. Одна лунка может быть использована для преобразования до 8 x 106 ячеек. Для каждой мыши костного мозга/печени/тимуса (BLT) будет имплантировано 0,5 x 106 CD34+ клеток вместе с CD34-клетками и тимусом под почечную капсулу, а 0,5 x 106 CD34+ клеток будут введены внутривенно. Количество используемых CD34+ клеток определяется количеством мышей (1 миллион клеток на мышь).
- Покройте необходимое количество 6-луночных лунок, не обработанных тканевой культурой, 1,25 мл рекомбинантного раствора человеческого фибронектина (например, ретронектина) (20 мкг/мл в PBS) в каждую лунку. Накройте тарелку крышкой и дайте ей постоять 2 часа при комнатной температуре в чистом шкафу биобезопасности.
- Аспиратируйте раствор фибронектина из лунок и добавьте в каждую лунку по 1,25 мл буфера для сортировки флуоресцентно-активируемых клеток (FACS) (PBS с 4% FBS) для блокирования. Дайте тарелке постоять при комнатной температуре (25 ºC) в течение 30 минут.
- Аспирируйте буфер FACS и промойте лунки один раз с помощью PBS.
- Храните PBS в лунках с покрытием до тех пор, пока пластина не будет готова к использованию. Храните тарелку при температуре 4 ºC в течение ночи, если не используете сразу.
- Поместите CD34+ клетки в инфекционную среду (2% сывороточного альбумина человека в бессывороточной Т-клеточной среде Yssel) в лунках, покрытых раствором фибронектина (~2 x 10,6 клеток/мл) и инкубируйте при 37 ºC в течение 1 часа.
- С помощью пипетки добавляйте лентивирусные векторы в лунки при кратности инфекции (MOI) от 2 до 10. Аккуратно перемешайте и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 ºC.
заметка: Титр используемого лентивирусного вектора должен быть определен заранее.
- Соберите клетки на следующий день, аккуратно соскребая дно лунок скребком для клеток. Соберите клетки и посчитайте с помощью гемоцитометра.
- Чтобы подготовить клетки для имплантата, объедините 0,5 x 106 трансдуцированных CD34+ клеток с 4,5 x 106 CD34-клеток на мышь, аликвоты в стерильные пробирки с винтовой крышкой объемом 1,5 мл. Раскрутите клетки вниз при 300 x g до гранулы и аспирируйте надосадочную жидкость. Снова вращайте их при давлении 300 x g, аспирируйте остатки надосадочной жидкости с помощью пипетки P10 и очень осторожно отсасывайте. Держите сухие гранулы на льду на протяжении всего исследования. заметка: Чтобы убедиться в жизнеспособности клеток, используйте гранулированные клетки и проведите операцию в течение 2-3 часов.
- Чтобы подготовить клетки к инъекции, спин 0,5 x 106 трансдуцированных CD34+ клеток на каждую мышь в гранулирование и аспирацию надосадочной жидкости. Ресуспендируйте клетки в среде RPMI по 100 мкл на мышь и держите на льду.
- Для проверки эффективности трансдукции аликвоту ~1 x 105 нетрансдуцированных и трансдуцированных CD34+ клеток из каждого состояния и культуры в среде цитокинов 200 мкл (среда RPMI с 10% FBS, дополненная 100 нг/мл человеческого IL-3, IL-6, SCF) в 96-луночном планшете в течение 5 - 7 дней при 37 ºC.
заметка: Клетки, используемые на этом этапе, используются не для хирургического вмешательства, а для обеспечения успешной трансдукции и отсутствия токсичности вектора для выживания и обновления стволовых клеток. Эффективность трансдукции может быть проверена путем поиска экспрессии генов вектора (например, GFP&CD4) и проанализирована с помощью проточной цитометрии.
- Трансплантация тканей для создания генетически модифицированных мышей
- В тот же день перед операцией проводится тотальное облучение тела НОД. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) мыши с ослабленным иммунитетом с облучателем цезия-137 и дозировкой 2,7 Гр (270Рад).
заметка: Мыши NSG имеют сильно ослабленный иммунитет. Поэтому их содержание и обслуживание должны соответствовать самым высоким санитарным нормам и обслуживаться высококвалифицированным персоналом.
- Высыпаем кусочки тимьяна и медиум из колбы в посуду диаметром 60 мм. Налейте PBS в другую посуду диаметром 60 мм, которая будет использоваться для очистки трохара и поддержания почки во влажном состоянии.
- Охладите наконечники пипеток положительного вытеснения, поместив их в открытые 1,5 мл стерильные пробирки с завинчивающейся крышкой на льду. Держите на льду с высушенными клеточными гранулами и желатиновой белковой смесью, такой как Matrigel.
заметка: Важно держать студенистую белковую смесь и любые трубки или наконечники, которые будут соприкасаться с ней, холодными до тех пор, пока игла имплантата не будет загружена.
- Обезболите мышей: взвешивайте мышей по отдельности и записывайте вес; ударяйте мышей по ушам, чтобы пронумеровать их. Введите им внутрибрюшинно 15 μл кетамина (2,6 мг/мл в физрастворе)/ксилазина (100 мг/мл в физрастворе) на грамм массы тела). Посадите мышей обратно в клетку и подождите, пока они полностью обезболятся.
заметка: Проверьте уровень анестезии мыши, сдавливая лапу. Если мышь рефлекторно вздрагивает, введите 25-50% от первоначального количества кетамина/ксилазина, чтобы обезболить мышь еще больше. Подождите, пока он не перестанет рефлекторно вздрагивать, чтобы выполнить операцию.
- С помощью машинки для стрижки (бритвы) Oster выбрейте левую сторону каждой мыши от бедра до плеча между центром спины и животом. Подкожно ввести 0,3 мл разведенного Карпрофена (6 мг/кг) в плечо или паховый треугольник (подошву ноги) животного. С помощью ватной палочки нанесите небольшую каплю искусственных слез на каждый глаз и положите мышь на бок обратно в клетку.
заметка: Ограничьте подготовку к операции одной клеткой (примерно 4 - 5 мышей) за один раз.
- Промойте канюлю иглы для раковых имплантатов (троакара) 16-го калибра с помощью PBS. С помощью пары тупых изогнутых щипцов поместите кусочек тимуса из чашки диаметром 60 мм в отверстие канюли так, чтобы троакар находился прямо внутри отверстия, затем потяните назад за троакар, чтобы аспирировать ткань в канюлю.
- С помощью пипетки прямого вытеснения и охлажденного наконечника налейте 5 μл холодной смеси студенистого белка в пробирку с высушенной клеточной гранулой (смесь CD34+ и CD34- для имплантированных клеток) и осторожно перемешайте для получения клеточной суспензии. Не пипетируйте вверх и вниз. Впрысните пипеткой смесь желатинового белка /клеточную суспензию в отверстие канюли и медленно потяните назад за троакар, чтобы загрузить иглу.
заметка: Рекомендуется иметь помощника для загрузки пипетки во время манипуляций с иглой имплантата.
- Промокните выбритый участок мыши Повидон-йодом и впоследствии протрите участок спиртовой салфеткой три раза. Определите самое темное пятно под кожей. Это указывает на расположение селезенки. Почка находится примерно в 5 мм дорсально от селезенки. Подтяните кожу изогнутыми щипцами и сделайте разрез длиной 15 мм хирургическими ножницами на коже параллельно селезенке. Затем сделайте аналогичный надрез в слое брюшины ниже. У самцов почка должна быть хорошо видна и может быть выдавлена простым нажатием на живот. Поддержать почку можно с помощью кровоостанавливающего средства или изогнутых тупых щипцов. У женщин яичники, как правило, блокируют почку от легкого извлечения. С помощью гемостата подхватить яичник и аккуратно обнажить почку.
- С помощью щипцов с игольчатым наконечником проделайте крошечное отверстие на заднем конце капсулы почки.
заметка: Не используйте эти щипцы с игольчатыми наконечниками для работы с биологически опасными материалами.
- Вставьте иглу имплантата в это отверстие и вдоль почки до тех пор, пока отверстие канюли не будет полностью закрыто капсулой почки.
- Аккуратно выдавите ткань под капсулой почки и вытяните иглу обратно. Кусочки тимуса могут быть липкими, поэтому используйте изогнутые щипцы, чтобы убедиться, что кусочек тимуса не выходит вместе с иглой.
- Поднимите брюшину с помощью щипцов и аккуратно с помощью кровоостанавливающего средства верните почку на место. Завяжите один двухузловой стежок в брюшине с помощью рассасывающихся швов 4-0 викрила. Используйте два зажима для намотки Autoclips, чтобы закрыть кожу.
- Смешайте трансдуцированные CD34+ клетки, отложите для инъекций и возьмите 100 мкл (0,5x106 клеток) в инсулиновый шприц. Вводите эти клетки мышке с помощью инъекции в ретроорбитальную вену или другими способами внутривенной инъекции. С помощью ватного тампона нанесите небольшую каплю искусственных слез на каждый глаз и положите мышь на бок обратно в клетку.
- После того, как все мыши будут имплантированы, убедитесь, что животные приходят в сознание и нормально передвигаются, прежде чем покинуть их.
- Послеоперационный уход: Подкожно введите 0,3 мл разведенного карпрофена (6 мг/кг) и 1,2 мл стерильного физиологического раствора каждой мыши на следующий день после операции. Через 2 и 3 дня после операции подкожно введите по 1,5 мл стерильного физиологического раствора каждой мыши. Наблюдайте за мышами и разрезами в течение 10-14 дней после операции. Снимите автоклипсы и взвесьте мышей через 10-14 дней. заметка: Мыши становятся вялыми после облучения, а инъекция физиологического раствора предотвращает обезвоживание животных.
- Через 8-10 недель проверьте приживление путем обескровливания мышей и проведения анализа FACS периферической крови, окрашивая ее на такие маркеры, как CD45, CD3, CD4, CD8, а также любые гены, которые должен экспрессировать вектор.