Получение везикул плазматической мембраны из стволовых клеток костного мозга

Аннотация

Источник: Xu, L. et al., Получение плазматических мембранных везикул из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для потенциальной цитоплазменной заместительной терапии.J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует метод создания плазматических мембранных везикул из стволовых клеток костного мозга путем их быстрого пропускания через мембранный фильтр. Эти ПМВ демонстрируют потенциал для заместительной цитоплазменной терапии.

Протокол

1. Сборка аппарата

1. Для обеспечения стерильности перед использованием включите ультрафиолетовое (УФ) излучение вытяжки для культуры тканей на 30 минут.
2. Открутите одноразовый фильтрующий блок диаметром 25 мм и погрузите крышку и дно блока в стеклянную чашку объемом 200 мл, наполненную 75% этанолом, на 30 минут. Агрегат изготовлен из медицинского полипропилена.
3. Поднимите крышку и дно устройства с помощью щипцов, стряхните остатки этанола вручную и дайте деталям высохнуть на воздухе в течение 10 минут в капюшоне.
4. Смочите мембрану из поликарбоната толщиной 19 мм в фосфатно-солевом буфере (PBS) и осторожно поместите ее поверх поддерживающей матрицы в нижней части устройства. Полимерная пленка имеет гладкую плоскую поверхность и протравленные на дорожке поры размером 3 мкм.
5. Соберите устройство, плотно прикрутив крышку к дну. Следите за тем, чтобы мембрана не сместилась от центра.
6. Извлеките иглу инсулинового шприца объемом 1 мл и наберите 1 мл PBS. Прикрепите шприц к фильтрующему блоку, а затем протолкните PBS через блок, чтобы намочить узел и проверить, нет ли утечки.

2. Генерация плазматических мембранных везикул (PMV)

1. Создание культуры мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (BMSC), как сообщают Nemeth et al., в культуральной среде Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), содержащей 15% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина. Культивируйте клетки в 6-луночном планшете во влажном инкубаторе, содержащем 5%_CO2 при 37 °C.
2. Для размножения клеток удалите питательную среду и промойте лунку 0,5 мл PBS, не содержащей кальция.
3. Добавьте 0,5 мл 0,25% трипсин-этилендиамина тетрауксусной кислоты (трипсин-ЭДТА) и инкубируйте клетки при 37 °C в течение 3 мин. Пару раз постучите пластиной по ладони, чтобы облегчить отслоение клеток. Остановите пищеварение, добавив 1 мл питательной среды.
4. Соберите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл и вращайте при температуре 200 x g в течение 2 минут в настольной центрифуге. Ресуспендируйте клетки в 4 мл питательной среды и аликвотируйте клетки в две лунки 6-луночного планшета. <бр/> заметка: Клетки обычно достигают слияния примерно через 24 часа.
5. Чтобы получить PMV, соберите клетки из одной лунки (примерно 5 x 10⁵ клеток) 6-луночного планшета путем расщепления трипсина и монодиспергируйте клетки в 0,5 мл питательной среды.
6. Загрузите клетки в инсулиновый шприц, прикрепите его к фильтрующему блоку и быстро нажмите на поршень, чтобы выдавить клетки через фильтр. Выбросьте экструдированный носитель, потому что внутри него должно быть всего несколько PMV.
7. Загрузите в шприц дополнительно 0,5 мл среды и быстро протолкните ее через фильтр. Собирается среда второй экструзии, которая содержит ПМВ различных размеров.
8. Загрузите 150 мкл собранной среды в чашку со стеклянным дном диаметром 35 мм и дайте PMV осесть на дно в течение примерно 10 мин. Исследуйте PMV под инвертированным фазово-контрастным микроскопом, оснащенным ПЗС-камерой, с помощью объектива 20X.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Мембраны IsoporeTM	Многородность	TSTP04700	3 мм пора
Одноразовый фильтрующий блок	Синья, Шанхай, Китай	25 мм	Полипропилен медицинский
Инсулиновый шприц	БД	328446	1 мл