Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. УФ-мутагенез для получения ауксотрофных штаммов дрожжей
- Построение кривых выживаемости для определения необходимых доз ультрафиолетового (УФ) излучения
- Приготовьте среды YPD (дрожжевой экстракт, пептон декстроза) и другие реагенты, перечисленные в таблице 1, в соответствии со стандартными процедурами и инокулируйте отдельные колонии в 5-10 мл среды YPD. Инкубировать культуры на вальцовом барабане при 30 °C O/N до насыщения в течение не менее 8 часов.
- Определите концентрацию клеток ночных культур (O/N) с помощью спектрофотометра путем разведения клеток 1:10 в воде в пластиковой кювете. Разведите клетки до концентрации 107 клеток/мл в 20 мл стерильной дистиллированной воды.
- Вылейте разбавленные ячейки в стерильную пластиковую чашку Петри и, сняв крышку, поместите пластину на 14 см ниже УФ-лампы.
- Подвергать клетки последовательным дозам УФ-облучения в дозах 5000 мкДж и 10000 мкДж, извлекая 500 мкл клеток после каждого приращения таким образом, чтобы клетки отбирались после воздействия 0 мкДж, 5000 мкДж, 10 000 мкДж, 15 000 мкДж, 20 000 мкДж, 25 000 мкДж, 30 000 мкДж, 40 000 мкДж, и 50 000 мкДж ультрафиолетового излучения. Перенесите извлеченные образцы клеток в стерильные пробирки объемом 1,5 мл и последовательно разбавьте с шагом 1:10 в стерильной воде.
- Гранулированные клетки в каждом разведении центрифугированием в микроцентрифуге при 16000 x g в течение 1 мин. Аспират супернатант и ресуспендирование в объеме 100 мкл стерильной воды, подходящем для осаждения дрожжевых клеток. Пипетируйте весь объем ресуспендированных клеток на планшеты, содержащие твердую среду YPD, и используйте стерильный распределитель для равномерного распределения клеток по каждой пластине.
- Оберните края пластин парапленкой, чтобы предотвратить высыхание среды, и накладки алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фотореактивацию и репарацию мутаций, вызванных ультрафиолетовым излучением. Инкубируйте чашки вверх дном при температуре 30 °C в течение 2-4 дней, чтобы обеспечить рост жизнеспособных колоний дрожжей (Рисунок 1).
- Подсчитайте количество колоний, по желанию с помощью ручки для обозначения подсчитанных колоний, портативного электронного контрпера или подставки для счетчика с увеличением. График в процентах от общего количества покрытых клеток при каждой дозе УФ-облучения μДж для построения кривой выживаемости облученных дрожжей (Рисунок 2).
Можно ожидать, что гаплоидные штаммы дрожжей потребуют более низких доз ультрафиолетового облучения по сравнению с диплоидными штаммами для достижения того же процента выживаемости. Штамм дрожжей, лишенный функциональных ферментов репарации ДНК, такой как мутант rad1 S. cerevisiae, может быть использован в качестве положительного контроля для указания на присутствие ультрафиолетового облучения в очень низких дозах.
- Определите дозу УФ-мутагенеза, которую следует использовать для скрининга, обратившись к кривой выживаемости, установленной в. 1.1.7. Значение x точки на кривой выживаемости, где y равно 50, является дозой ультрафиолетового облучения, при которой выживают 50% дрожжей. Скрининг мутантов при таком низком проценте выживаемости может привести к более высокому выходу успешно мутировавших штаммов, особенно диплоидных дрожжей. 50% выживаемость для WT S. boulardii, как показано на рисунке 2, составляет примерно 18 000 μДж.
Примечание: Несмотря на то, что такие высокие дозы ультрафиолета увеличивают риск мутаций в генах клеточных путей, отличных от интересующего гена ауксотрофного маркера, этот недостаток должен быть сбалансирован с необходимостью индуцировать мутации в обеих копиях гена ауксотрофного маркера. Для гаплоидных штаммов, в которых должна быть мутирована только одна копия гена, скрининг при более высоком проценте выживаемости, например, при 90%, снижает риск дополнительных мутаций и все еще позволяет обеспечить достаточное генерирование ауксотрофных мутантов.
- УФ-мутагенез и скрининг на ауксотрофные штаммы дрожжей
- Приготовьте дрожжи, как описано в пунктах 1.1.1-1.1.3.
- Дрожжи подвергают воздействию дозы УФ-излучения, соответствующей 50% выживаемости, как определено в 1.1.8. Для WT S. boulardii эта доза была определена примерно в 18 000 мкДж (рис. 2).
- Соберите 1 мл облученных УФ-излучением дрожжей и гранул путем центрифугирования в микроцентрифуге при 16 000 х г в течение 1 мин. Аспират надосадочная жидкость и ресуспендируйте клетки в 100 мкл стерильной воды.
- Отбор мутантов
- При использовании отбора, например, в случае с ура3-ауксотрофными мутантами, дрожжи облучают в среду, содержащую 5-фтороротовую кислоту (5-FOA), для отбора клеток, лишенных функционального фермента Ura3><.
Примечание: Любые дрожжи, содержащие функциональные копии Ura3, преобразуют 5-FOA в токсин 5-фторурацил, что приводит к гибели клеток и позволяет легко выбирать колонии Ura3, в которых отсутствует функциональный Ura3. Аналогичные подходы к отбору возможны для LYS2 и LYS5; ГТР1;и маркеры MET2 и MET15 с использованием сред, содержащих α-аминоадипиновую кислоту; 5-фторантраниловая кислота; и метилртуть, соответственно.
- Пипетируйте 100 мкл ресуспендированных клеток на минимальном количестве среды, содержащей 5-FOA, и используйте стерильный разбрасыватель для равномерного покрытия планшета. Оберните пластины парапленкой и выдерживайте вверх дном при температуре 30 °C в течение 2-4 дней, чтобы обеспечить рост жизнеспособных колоний дрожжей.
- Подтвердите фенотип ura3- любой колонии, появляющейся на пластинах 5-FOA, путем ретрикинга на пластинах YPD, урацил- и 5-FOA (рис. 3). Используйте кончик стерильной зубочистки, чтобы собрать часть одной колонии, и осторожно перетащите клетки через свежие пластины YPD, урацил- и 5-FOA. Снова инкубируйте завернутые тарелки вверх дном при температуре 30 °C в течение 2-4 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособные колонии будут выглядеть как приподнятые, примерно круглые наросты, в то время как нежизнеспособные клетки будут выглядеть только как непрозрачный мазок без каких-либо выпуклых наростов (Рисунок 3).
- Скрининг мутантов
- При создании ауксотрофного мутанта, для которого методы отбора недоступны, приготовьте серийные разведения дрожжевых клеток, облученных ультрафиолетовым излучением, в соотношении 1:10 в стерильной воде и пипетируйте разведения на среде YPD, используя стерильный разбрасыватель для равномерного покрытия планшета.
- Оберните пластины в парапленку и выдерживайте вверх дном при температуре 30 °C в течение 2-4 дней. Определите, какое разведение позволило разрасти отдельные колонии, которые можно легко отличить друг от друга, обычно не более примерно 100 колоний на пластине.
- Повторите УФ-мутагенез образцов дрожжей, описанных в пунктах 1.2.1-1.2.3, и клеток планшета при этом определенном разведении. Разбавленные дрожжи пипеткой нанесите на среду YPD, используйте стерильный разбрасыватель для распределения клеток и инкубируйте завернутые пластины вверх дном при температуре 30 °C в течение 2-4 дней.
- Скрининг на ауксотрофы путем нанесения реплики на селективные среды, лишенные интересующего метаболита. Сначала закрепите стерильную бархатную прокладку на подставке для тарелки и переверните пластину с колониями, облученными ультрафиолетовым излучением, на бархате, отметив ориентацию пластины.
- Затем переверните свежую пластину, в которой отсутствует интересующий метаболит, на бархат и слегка надавите, чтобы перенести клетки из бархата в пластину. Храните оригинальную тарелку при температуре 4 °C. Оберните и выдержите новую тарелку вверх дном при температуре 30 °C в течение 2-4 дней.
- В качестве альтернативы покрытию реплик можно проводить скрининг мутантов путем пересадки колоний из YPD на селективные среды. Используйте кончик стерильной зубочистки, чтобы собрать часть одной колонии, и осторожно перетащите клетки через свежую пластину YPD и пластину, в которой отсутствует интересующий метаболит. Снова инкубируйте завернутые тарелки вверх дном при температуре 30 °C в течение 2-4 дней. <бр/>
Примечание: Необходимо проявлять осторожность при выборе одиночных колоний и выделении колоний несколько раз, чтобы подтвердить однородную популяцию истинных ауксотрофных клеток.
- Дополнительно подтвердите фенотип облученных клеток путем инокуляции отдельных колоний в 5-10 мл как YPD, так и среды, в которых отсутствует соответствующий метаболит (например, в урацил-среде для ura3-мутанта). Инкубировать на роликовом барабане при 30 °C O/N для подтверждения роста клеток в среде YPD, но не в отсутствие метаболита.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что характер роста на твердых средах должен ясно указывать на ауксотрофный статус дрожжей, некоторые дрожжи могут переносить стрессы и образовывать небольшие, медленно растущие колонии на твердых средах, но при этом не переносить те же условия в жидких средах (неопубликованные наблюдения). Таким образом, инокуляция в жидкие культуры должна быть выполнена для полного подтверждения закономерностей роста мутантов, облученных ультрафиолетом.
- Для длительного хранения подтвержденных ауксотрофных мутантов подготавливают запасы глицерина путем инокуляции клеток в 10 мл YPD и инкубации на роликовом барабане O/N при 30 °C. Гранулированные клетки центрифугируют в течение 3 мин при 2500 x g и аспирационной среде. Ресуспендируйте клетки в 50% стерильном фильтрованном глицерине, перенесите в криовиальную камеру и храните при -80 °C. <бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: УФ-мутагенизированные дрожжи потенциально содержат мутации в нескольких генах, отличных от интересующего ауксотрофного маркера. Прежде чем продолжить использование верифицированных ауксотрофных мутантов, эти штаммы должны быть дополнительно проанализированы с помощью секвенирования генов и оценки устойчивости к pH, стрессам желчных кислот и другим характеристикам, относящимся к пробиотическим штаммам, как описано в другом месте2. Кроме того, использование гомологии ПЦР или нацеливания CRISPR/Cas9 для более селективной мутации ауксотрофных маркеров следует рассматривать в качестве альтернативы УФ-мутагенезу.
2. Трансформация дрожжей
- LiOAc трансформация дрожжей
- Инокулируйте одиночные колонии дрожжей в 5-10 мл среды YPD и инкубируйте на роликовом барабане при 30°C O/N.
- Чтобы индуцировать рост логарифмической фазы и повысить эффективность поглощения плазмид, определите концентрацию клеток с помощью спектрофотометра для измерения разведения клеток в стерильной воде в пластиковой кювете в соотношении 1:10. Разведите О/N культуры до оптической плотности при 600 нм (OD600) 0,16-0,2 (примерно 2 x 10 6-2,5 x 106 клеток/мл) в 50 мл свежей теплой YPD и инкубируйте клетки на орбитальной платформе, настроенной на 200 об/мин, пока культура не достигнет примерно 1 x 107 клеток/мл, Обычно около 4 часов <чел/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность трансформации может быть измерена как функция количества успешно трансформированных колониеобразующих единиц дрожжей (КОЕ) на μг плазмидной ДНК. Повышенная эффективность приводит к большему количеству трансформированных колоний на мкг плазмидной ДНК. Субкультивирование дрожжевых клеток и их сбор во время роста в логарифмической фазе является одним из факторов, повышающих эффективность трансформации.
- Пеллетные ячейки методом центрифугирования при давлении 2 500 x g в течение 3 мин.
- Отсадите надосадочную жидкость и перенесите клетки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, повторно суспендируя гранулу в 1 мл стерильной воды.
- Гранулированные ячейки центрифугированием при 16 000 x g в течение 1 мин в микроцентрифуге, аспирируют надосадочную жидкость и промывают клетки путем ресуспендирования в 1 мл TE/LiOAc (Tris EDTA/ацетат лития) буфере.
- Повторите центрифугирование и ресуспендируйте клетки в буфере TE/LiOAc до концентрации 2 x10-9 клеток/мл.
- Приготовьте трансформационные смеси с каждым из следующих компонентов: 50 мкл подготовленных дрожжей в буфере TE/LiOAc, 5 мкл ДНК-носителя (10 мкг/мкл) и 1 мкл плазмидной ДНК (1 мкг). Микрограммы плазмидной ДНК могут быть титрованы, так как увеличение количества ДНК может привести или не привести к повышению эффективности трансформации.
Примечание: Для мутантного штамма дрожжей, не имеющего одного ауксотрофного маркера, только одна плазмида, кодирующая маркер, может быть преобразована в одном образце. Кроме того, использование плазмиды, кодирующей легко обнаруживаемый белок, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP), позволит эффективно определять правильное сворачивание и экспрессию гетерологичного белка штаммом дрожжей после трансформации.
- К каждому препарату добавьте по 300 μл PEG/LiOAc/TE и тщательно перемешайте. Инкубация интактных клеток с полиэтиленгликолем (ПЭГ) имеет важное значение для эффективной трансформации.
- Инкубировать препараты при 30 °C в течение 30 минут с перемешиванием, поместив микроцентрифужные пробирки в стакан, помещенный на орбитальный платформенный шейкер со скоростью 200 об/мин.
- Добавьте по 35 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) в каждую ячейку реакции и теплового шока в течение 15 минут на водяной бане при температуре 42 °C. Несмотря на противоречивые сообщения о дополнительных преимуществах ДМСО, было показано, что тепловой шок неповрежденных дрожжевых клеток значительно повышает эффективность трансформации.
- Промывайте клетки путем гранулирования центрифугированием, как в пункте 2.1.5, путем аспирации или пипетирования надосадочной жидкости и повторного суспендирования в 1 мл стерильной воды. Осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы разбить гранулу клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно тщательно удалить надосадочную жидкость, потому что среда, используемая для создания компетентных клеток, может подавлять рост дрожжей и образование колоний.
- Повторите гранулирование клеток, как показано в пункте 2.1.5, аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 100 мкл стерильной воды. Нанесите пипеткой весь объем на селективную пластину и с помощью стерильного распределителя равномерно покройте пластину трансформированными дрожжами.
- Оберните края пластин с покрытием парапленкой, чтобы предотвратить высыхание среды, и инкубируйте вверх ногами при 30 °C в течение 2 дней, чтобы обеспечить рост трансформированных дрожжевых клеток. Успешный, эффективный трансформационный и ауксотрофный отбор Saccharomyces cerevisiae дает большое количество колоний на один препарат трансформации, хотя для других штаммов урожайность может быть значительно ниже (рис. 4).
- Хранить дрожжевые пластины в течение короткого периода времени (обычно 1-3 недели) вверх дном и накрыть крышкой при температуре 4 °C. Подготовьте запасы глицерина из трансформированных дрожжей, как описано в. 1.2.5, для длительного хранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимы дальнейшие исследования, тестирующие трансформированные КОЕ, для определения стабильности плазмид и оценки надлежащей экспрессии гетерологичного белка. Подробное описание стабильности плазмид, использование иммуноблоттинга для обнаружения денатурированных белков, извлеченных из образцов клеток, иммуноферментный анализ (ИФА) для обнаружения правильно свернутых трехмерных белков, а также использование GFP в исследованиях дрожжей доступны в других источниках. На Иллюстрации 5 показано репрезентативное изображение успешной экспрессии GFP в трансформированных S. cerevisiaeотносительно нетрансформированных клеток. Использование такого флуоресцентного белка является одним из средств эффективного определения успешного производства гетерологичного белка.
- Электропорация дрожжей
- Инокулируйте одиночные колонии дрожжей в 5-10 мл среды YPD и инкубируйте на роликовом барабане при 30 °C O/N.
- Определите концентрацию клеток с помощью спектрофотометра для измерения разведения клеток в стерильной воде в соотношении 1:10. Разведите культуры O/N в 100 мл свежей теплой среды YPD до эквивалента наружного диаметра600, равного примерно 0,3. Инкубируйте субкультуры при 30 °C на орбитальной платформе, настроенной на 200 об/мин, до достижения наружного диаметра600 примерно 1,6, обычно 4-5 часов. Каждая субкультура объемом 100 мл будет генерировать достаточное количество кондиционированных клеток для двух реакций трансформации.
- Гранулированные клетки центрифугированием при 2500 x g в течение 3 мин. Аспирируют надосадочную жидкость и промывают клетки, повторно суспендируя в 50 мл ледяной стерильной воды. Повторите промывку, гранулируя ячейки, аспирируя надосадочную жидкость и повторно суспендируя в свежей 50 мл ледяной стерильной воды.
- Снова гранулируйте клетки и повторно суспендируйте в 50 мл ледяного буфера для электропорации (1 М сорбита, 1 мМ хлорида кальция (CaCl2)).
- Повторите спин, как в 2.2.3, аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 20 мл 0,1 М LiOAc/10 мМ дитиотреитола (DTT). Инкубировать клеточную суспензию на роликовом барабане при 30 °C в течение 30 мин. Преинкубация клеток в LiOAc и DTT синергетически повышает эффективность электропорации.
- Гранулируйте ячейки, как в пункте 2.2.3, удалите надосадочную жидкость и промойте, повторно суспендировав в 50 мл ледяного электропорационного буфера. Повторите центрифугирование и ресуспендируйте клетки в ледяном буфере для электропорации до конечного объема 1 мл.
- Приготовьте на льду: кондиционированные дрожжевые клетки, стерильные электропорационные кюветы и плазмидную ДНК. Сразу после окончательной ресуспензии кондиционированных клеток в 1 мл электропориционного буфера соедините 400 мкл кондиционированных дрожжевых клеток с примерно 1 мкг плазмидной ДНК и добавьте в ледяную электропорационную кювету 0,2 мкм. Использование большего количества ДНК может незначительно повысить эффективность трансформации. Инкубировать реакцию на льду в течение 5 мин, затем электропорировать электропоратором, установленным на 2,5 кВ и 25 мкФ. <бр/>
Примечание: Как описано в пункте 2.1.7, мутантный штамм дрожжей, лишенный одного ауксотрофного маркера, может быть преобразован с использованием только одной плазмиды, кодирующей мутировавший маркер на образец. Кроме того, использование плазмиды, которая кодирует легко обнаруживаемый белок, такой как GFP, позволяет эффективно определять правильное сворачивание и экспрессию гетерологичного белка после трансформации.
- Перенесите электропорированные клетки в 8 мл смеси сорбита YPD:1 M в соотношении 1:1 и дайте клеткам инкубироваться на роликовом барабане при 30 °C в течение 60 минут.
- Пеллетные ячейки как в 2.2.3 и ресуспендированные в 100 мкл 1:1 YPD:1 М сорбита. Поместите весь объем на селективную среду, содержащую 1 М сорбит, оберните края пластин парапленкой и инкубируйте чашки вверх дном при 30 °C в течение 2-5 дней, чтобы обеспечить рост трансформированных дрожжевых клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно тестировать трансформированные дрожжи для оценки правильной экспрессии гетерологичного белка, как описано в 2.1.14 и 2.2.7.
- Оральный зонд мышей с трансформированными дрожжами
- Выполнять все процедуры по уходу за животными и обращению с ними в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию и одобрением Комитета по уходу и использованию институциональных животных.
- Дрожжевые культуры готовят О/N дрожжевыми культурами путем инокуляции одиночных колоний трансформированных ауксотрофных дрожжей в 5-10 мл селективной среды. Инкубировать культуры O/N не менее 8 ч на вальцовом барабане при 30 °C до насыщения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование плазмид, кодирующих тестовые белки, такие как GFP, позволит упростить тестирование экспрессии белка в дрожжах, обработанных газированными дрожжами, как описано в пункте 4.7.
- Для максимальной индукции экспрессии белка и индуцирования роста логарифмической фазы получают субкультуры из культур O/N путем разбавления до эквивалента наружного диаметра600 приблизительно 0,16-0,2 в 50 мл соответствующей среды, как описано в 2.1.2.
- Определите концентрацию субкультивируемых клеток, как в 1.1.2, и отрегулируйте до 109 клеток/мл. Приготовьте дозу 100 мкл для каждой мыши, с несколькими сотнями мкл дополнительного объема на группу для повышения точности и простоты загрузки образцов.
- Гранулированные клетки путем центрифугирования при 2500 х г в течение 3 мин или в микроцентрифуге при 16 000 х г в течение 1 мин. Аспират надосадочная жидкость и ресуспендирование клеток путем добавления равного объема стерильной воды и осторожного пипетирования вверх и вниз.
- Закрепите подходящую иглу для зондирования (22 г для мышей 15-20 г) на стерильный шприц объемом 1 мл и загрузите образец дрожжей, убедившись, что все пузырьки удалены, и установите поршень на шаг 100 мкл. Загрузите дополнительный шприц со стерильной водой для зондовых мышей и проверьте наличие загрязняющих дрожжей.
- Возьмите мышь, которую нужно зацепить, недоминирующей рукой, указательным и большим пальцами плотно сжимайте кожу вокруг шеи (рисунок 5A). Подверните хвост под мизинец, чтобы предотвратить движение нижней части тела. Убедитесь, что захват надежно закреплен и не позволяет мыши двигать головой, чтобы предотвратить повреждение внутренних тканей во время зондирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените, на какое расстояние следует ввести иглу для зондажа, прижимая иглу к мыши так, чтобы луковица находилась на одном уровне с мечевидным отростком грудины. Введение иглы такой длины обычно позволяет игле зондажа проникнуть в желудок.
- Доминирующей рукой осторожно введите иглу для зонда в пищевод мыши, наклоняя иглу вдоль нёба и задней части горла, держа немного левее центра. Подождите, пока мышь проглотит колбу иглы, и дайте игле опуститься немного дальше до точки, оцененной в 3,7 (рис. 5B). Если во время введения иглы зондажа ощущается какое-либо сопротивление или если мышь в любой момент начинает задыхаться, осторожно извлеките иглу и снова попытайтесь найти пищевод.
- После того, как мышь проглотит колбу иглы для зондажа, осторожно нажмите на поршень шприца, чтобы ввести 100 мкл (108 КОЕ) дрожжей непосредственно в желудок мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что мыши не могут испытывать рвоту после введения раствора, во время зондирования может возникнуть рефлюкс. Правильное введение иглы для зондажа, а также регулировка объема и вязкости раствора могут помочь ограничить рефлюкс и обеспечить точное дозирование.
- Осторожно извлеките иглу для зонда из желудка мыши и пищевода и верните мышь в клетку. Убедитесь, что мышь дышит и двигается нормально после зондажа, чтобы убедиться, что игла зондажа была правильно введена на протяжении всей процедуры и что раствор не аспирировался.
Таблица 1. Список реагентов. Описаны реагенты, необходимые для изготовления каждого из растворов, дрожжевые среды и планшеты, а также буферы для трансформации, используемые для протоколов в данной рукописи.
| Решения | Дрожжевые среды и пластины | Реагенты для трансформации |
| Полиэтиленгликоль (ПЭГ) 50%: | YPD: | TE/LiOAc: |
| 250 г PEG 3350 | 20 г пептона | 50 мл 10x TE |
| 500 мл стерильной воды | 20 г декстрозы | 50 мл 10x (1M) LiOAc |
| Фильтр стерилизованный | 10 г дрожжевого экстракта | 400 мл стерильной воды |
| 1 л воды | Фильтр стерилизованный |
| автоклав | |
| TE 10x: | Пластины YPD: | PEG/TE/LiOAc: |
| 100 мМ Трис | 20 г пептона | 400 мл 50% ПЭГ |
| 10 мМ ЭДТА | 20 г декстрозы | 50 мл 10x TE |
| рН до 7,5 и фильтр стерилизовать | 20 г агара | 50 мл 10x (1M) LiOAc |
| 10 г дрожжевого экстракта | |
| 1 л воды | |
| автоклав | |
| 20% глюкозы: | Урацил - селективные среды | Носительская ДНК (SS ДНК): |
| 200 г декстрозы | 2 г аминокислотной смеси без урацила | Хранить при температуре -20 °C и перед использованием нагреть в течение 1-2 минут при 100 °C для растапливания прядей и хранить на льду |
| 1 л воды | 6,7 г азотной основы дрожжей без аминокислот | |
| Фильтр стерилизованный | 1 л воды | |
| Стерилизация путем автоклавирования или стерильной фильтрации | |
| Добавьте 20% глюкозы в соотношении 1:10 перед употреблением | |
| 50% глицерина: | Урацил-пластины: | Буфер для электропорации: |
| 500 мл глицерина | В колбе объемом 250 мл: | 1 м сорбита |
| 500 мл воды | 2 г аминокислотной смеси без урацила | 1 мМ CaCl2 |
| автоклав | 6,7 г азотной основы дрожжей без аминокислот | Залить дистиллированной водой |
| 150 мл воды | Автоклавировать и хранить при температуре 4 °C |
| В колбе объемом 2 л: | |
| 20 г агара | |
| 750 мл воды | |
| Автоклавные колбы отдельно, затем смешайте вместе со 100 мл 20% глюкозы | |
| Полный IMDM | Пластины 5-FOA+: | LiOAc/DTT |
| 500 мл модифицированной среды Дульбекко от Iscove | Автоклав в колбе объемом 2 л: | 0,1 млн LiOAc |
| 5 мл пенициллина стрептомицина глутамина 100x | 20 г агара | 10 мМ DTT |
| 500 мкл 2-меркаптоэтанола | 750 мл воды | |
| 10% инактивированная теплом фетальная бычья сыворотка | смешивать: | |
| 2,5 мл пирувата натрия 100 мМ | 6,7 г азотной основы дрожжей без аминокислот | |
| 2 г смеси аминокислот без урацила | |
| 150 мл теплой воды | |
| Когда остынет, добавьте: | |
| 0,05 г порошка урацила | |
| 1 г 5-FOA | |
| Перемешать и процедить, стерилизовать | |
| Добавить в автоклавный раствор агара | |
| Смешайте со 100 мл 20% глюкозы | |
