Генерация антиангиогенных опухолеассоциированных нейтрофилов

Аннотация

Источник: Пылаева, Э., и др. Перенос манипулированных опухолеассоциированных нейтрофилов у мышей с опухолями для изучения их ангиогенного потенциала in vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует анализ для создания антиангиогенных нейтрофилов, ассоциированных с опухолью (TANs). При взятии опухоли меланомы мыши, содержащей проангиогенные TANs, отдельные клетки выделяют с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) и обрабатывают ингибитором никотинамида фосфорибозилтрансферазы (NAMPT) для снижения способности стимулировать ангиогенез.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

ПРИМЕЧАНИЕ: Общая схема протокола показана на рисунке 1.

1. Получение клеточной линии меланомы B16F10

1. Подготовьте микоплазмоотрицательные клетки, выращенные до 90% сливающегося монослоя (приблизительно 10 x 10⁶ клеток/колба T75) в полной модифицированной среде Dulbecco's Medium от Iscove (IMDMc: IMDM + 10% фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) + 1% пенициллин-стрептомицин).
2. Удалите среду и промойте клетки фосфатно-солевым буфером (PBS). Нанесите 6 мл раствора для отслоения клеток, содержащего протеолитические и коллагенолитические ферменты (см. Таблицу материалов), и инкубируйте при 37 °C в течение 2 мин.
3. Осторожно постучите по колбе, чтобы мобилизовать оставшиеся прилипшие клетки со дна. Соберите клеточную суспензию в пробирки объемом 15 мл и центрифугируйте при 300 x g в течение 7 мин и 20 °C.
4. Удалите надосадочную жидкость, и хорошо суспендируйте гранулу в 1 мл PBS. Добавьте 14 мл PBS и центрифугу (300 x g и 20 °C в течение 7 минут).
5. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл PBS.
6. Подсчитайте клетки и ресуспендируйте их до концентрации 3 x 10⁶/мл PBS (для этапа 2) или 6 x 10⁶/мл PBS (для этапа 6) для инъекций. Держите клетки на льду не более 30 минут.

2. Модель аллогенной опухоли у мышей

1. Используйте 10 самок мышей Ifnar1-/- в возрасте 8-12 недель, которые содержатся в условиях, свободных от специфических патогенов (SPF).
   заметка: Самки мышей предпочтительнее в подкожной модели роста опухоли, так как самцы более агрессивны и, таким образом, склонны к инфарктам опухолевого участка, что влияет на рост опухоли.
2. Выбрейте кожу мыши с боковой стороны электробритвой, а кожу продезинфицируйте салфеткой, влажной с 70% этанолом.
3. Соберите подготовленные клетки меланомы B16F10 в концентрации 3 x 10⁶/мл PBS (см. шаг 1) в шприц объемом 1 мл и иглу 0,4 x 19 мм. Введите 100 мкл суспензии подкожно.
   1. Хорошо перемешивайте клетки перед каждой инъекцией. Используйте иглы не менее 0,4 мм в диаметре, чтобы не нарушить опухолевые клетки.
4. Поместите до 5 мышей в одну клетку и контролируйте размер опухоли (длину, ширину и глубину) с помощью штангенциркуля в течение 14 дней.
   заметка: Согласно правилам содержания животных, размер опухоли не должен превышать 15 мм в диаметре, мышей с более крупными или некротическими/открытыми опухолями следует предварительно умерливать.
5. На 14-й день принесите мышей в жертву в камере CO₂.
6. Продезинфицируйте кожу 70% этанолом и удалите опухоли ножницами и щипцами в стерильной чашке Петри. Храните опухоли в пробирке объемом 50 мл в полной модифицированной среде Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEMc: DMEM + 10% FBS + 1% пенициллин-стрептомицин) на льду.

3. Изоляция TAN

1. Поместите опухоли в стерильные 6-луночные планшеты, по 5 опухолей в лунке. Стерильными ножницами разрежьте опухоли на кусочки по 2-3 мм.
   1. Расщепляют с 1 мл раствора диспаза/коллагеназы D/DNase I (0,2 мг/0,2 мг/100 мг в 1 мл DMEMc) на опухоль. Инкубировать при 37 °C, 5%_CO2 во влажном инкубаторе и перемешивать шприцем объемом 10 мл без иглы каждые 15 мин 3 раза.
2. Чтобы удалить непереваренные волокна, поместите ячейки через фильтры 100 мкм в пробирки объемом 15 мл (по одной лунке на фильтр на пробирку). Добавьте PBS до 15 мл, центрифужные пробирки при 460 x g, 4 °C в течение 5 мин и удалите надосадочную жидкость.
3. Лизировать эритроциты с помощью буфера для лизиса (NH₄Cl 150 мМ, KHCO₃ 10 мМ, ЭДТА 0,1 мМ, pH 7,3, 20 °C) путем добавления по 1 мл в каждую пробирку. Хорошо перемешайте, и соедините раствор из всех пробирок в один. Остановите реакцию через 2 минуты с помощью 11 мл ледяного (4 °C) DMEMc.
4. Центрифугируйте при 460 x g, 4 °C в течение 5 мин и удалите надосадочную жидкость. Суспендируйте гранулу с 15 мл холодного PBS. Центрифугируйте при 460 x g, 4 °C в течение 5 мин и удалите надосадочную жидкость.
5. Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл PBS. Добавьте 3 мкл антител Fc-блока (CD16/CD32, запас 0,5 мг/мл) и инкубируйте на льду в течение 15 минут.
6. Добавьте антитела: 10 мкл Ly6G-фикоэритрина (Ly6G-PE, запас 0,2 мг/мл) и 10 μл CD11b-аллофикоцианина (CD11b-APC, запас 0,2 мг/мл). Добавьте 20 мкл красителя для повышения жизнеспособности 6-Диамидин-2-фенилиндола (DAPI, запас 5 мг/мл) и инкубируйте на льду в темноте в течение 30 мин.<бр/> заметка: Может быть использована другая комбинация красителей жизнеспособности и флуоресцентных конъюгатов антител.
7. Добавьте PBS до 15 мл, центрифугируйте при 460 x g, 4 °C в течение 5 минут и удалите надосадочную жидкость.
8. Суспендируйте гранулу в DMEMc до концентрации примерно 10 x 10⁶/мл и держите на льду.
9. Сортируйте CD11b⁺ Ly6G^hi живые (DAPI-отрицательные) нейтрофилы с помощью флуоресцентно-активируемого сортировщика клеток (стратегия гейтирования см. рис. 2).
   заметка: Пробирку с суспензией ячеек и пробирку с DMEMc для сортируемых клеток держите при температуре 4 °C. Используйте следующие оптимальные настройки сортировки: сопло 70 мкм, пороговая скорость не более 22 000 событий в секунду и скорость потока 1-3.
10. Проверьте чистоту отсортированных нейтрофилов с помощью цитометра на рекомендуемую чистоту >95%.
11. Центрифугируйте отсортированные нейтрофилы при 460 x g, 4 °C в течение 5 мин и удалите надосадочную жидкость. Ресуспендирование отсортированных клеток в DMEMc до концентрации 1 x 10⁶/мл.
    заметка: Ожидаемое количество нейтрофилов в одной 14-дневной опухоли B16F10 (диаметр 10 мм) составляет примерно 3 х^{10 4} клеток.

4. Ингибирование NAMPT в TANs in vitro

1. Приготовьте массу FK866 (ингибитор НАМПТ) в диметилсульфоксиде (ДМСО) в конечной концентрации 100 мМ.
2. Семена отсортировали нейтрофилы (шаг 3.11) в 2 лунки 96-луночного U-образного донного планшета (1,5 x 10⁵ нейтрофилов/лунка). Добавьте FK866 в интервенционную лунку (конечная концентрация 100 нМ) и равное количество DMEMc с ДМСО в контрольную лунку. Инкубировать в течение 2 ч при 37 °C, 5%_CO2 во влажном инкубаторе.
3. Центрифугируйте при 460 x g, 4 °C в течение 5 мин и удалите надосадочную жидкость. Ресуспендирование в 200 мкл PBS в каждой скважине. Повторите 2 раза.
4. Центрифугируйте при 460 x g, 4 °C в течение 5 мин и удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте в коммерческую среду для роста эндотелиальных клеток (с добавлением добавки для роста эндотелиальных клеток 4 мкл/мл, 0,1 нг/мл рекомбинантного эпидермального фактора роста человеческого эпидермиса, 1 нг/мл рекомбинантного основного фактора роста фибробластов человека, 90 мкг/мл гепарина и 1 мкг/мл гидрокортизона) до конечной концентрации 0,2 x 106 клеток/мл (в 0,75 мл) (для стадии 5) или в PBS до конечной концентрации 0,6 x 10⁶ клеток/мл ( в 0,25 мл).

Результаты

Рисунок 1. Схема протокола. Шаг 1. Получение клеточной линии меланомы B16F10; 2. Аллогенная модель опухоли у мышей; 3. Выделение ТАН из опухолей; 4. Ингибирование NAMPT in TANs in vitro; 5. Оценка ангиогенных свойств ТАН в кольцевом анализе аорты; 6. Адоптивный перенос обработанных нейтрофилов в модели аллогенной опухоли; 7. Мониторинг роста опухоли, гистологическое исследование.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Тубы 15 мл	Sarstedt AG & Co., Нюмбрехт, Германия	6,25,54,502
Тубы 50 мл	Celltar, Greiner Bio One International GmbH, Фрикенхаузен, Германия	227261
5 мл / 10 мл / 25 мл стерильные наконечники для автоматической пипетки	Celltar, Greiner Bio One International GmbH, Фрикенхаузен, Германия	6006180 / 607180 / 760180
6 луночных планшетов для клеточных культур с плоским дном	Sarstedt AG & Co., Нюмбрехт, Германия	8 33 920
96 луночных планшетов для культивирования клеток с плоским дном	Celltar, Greiner Bio One International GmbH, Фрикенхаузен, Германия	655180 (Английский
96-луночные U-образные планшеты для культивирования клеток	Celltar, Greiner Bio One International GmbH, Фрикенхаузен, Германия	65018
антимышь CD11b	Б.Д. Фармиген, Бектон Дикинсон, Франклин Лейкс, США	553312	клон M1/70, APC-конъюгированный, 0,2 мг/мл
антимышиный Ly6G	BioLegend, Калифорния, США	127608	клон 1A8, ПЭ-конъюгированный, 0,2 мг/мл
BD FACS AriaII	BD Biosciences, Бектон Дикинсон, Франклин Лейкс, США		Сортировщик ячеек
кронциркуль	Vogel Germany, Kevelaer, Германия
Счетчик ячеек Casy	Innovatis, Roche Innovatis AG, Билефельд, Германия
Стерильные фильтры Cell Trics 50 мкм / 100 мкм	Sysmex Partec GmbH, Гёрлиц, Германия	04-004-2327 / 04-004-2328
Центрифуга Rotina 420 R	Андреас Хеттих, Туттлинген, Германия	4706
Коллагеназа D	Sigma-Aldrich/Merck, Дармштадт, Германия	11088858001
DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол, дилактат)	BioLegend, Калифорния, США	422801	Запас: 5 мг / мл
Dispase I	Sigma-Aldrich/Merck, Дармштадт, Германия	Д4818-2МГ
DMEM	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США	41966-029	DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% пенициллин-стрептомицин
ДМСО (Диметилсуфоксид)	WAK-Chemie Medical GmbH, Штайнбах, Германия	ВАК-ДМСО-10	КриоСур-ДМСО
ДНКаза I	Sigma-Aldrich/Merck, Дармштадт, Германия	ДУ25-100МГ
ДПБС	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США	14190-094
Среда для роста эндотелиальных клеток	PromoCell, Гейдельберг, Германия	С-22010
FBS (фетальная сыворотка крупного рогатого скота)	Biochrom, Берлин, Германия	С0115
Fc-блок (Антимышь CD16/32)	Б.Д. Фарминген, Бектон Дикинсон, Бектон Дикинсон, Франклин Лейкс, США	553142	клон 2.4G2, Запас: 0.5мг/мл
ФК 866 гидрохлорид	Axon Medchem, Гронинген, Нидерланды	Аксон 1546	Складской запас: 100 мМ
Козий антикролиачий IgG H&L	Абкам, Кембридж, Великобритания	АБ97075	Cy3-конъюгированный, запас: 0,5 мг/мл
CO2-инкубатор Heracell 240i	Thermo Fisher Scientific, Уолтем, США	51026334
ИМДМ	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США	12440-053	IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% пенициллин-стрептомицин
Бритва Isis GT420	Б. Браун Аскулап, Зуль, Германия	90200714
Базальная мембрана Matrigel Matrix	Corning Life Sciences, Амстердам, Нидерланды	7205011
Моноклональный антиактин, α-гладкие мышцы	Sigma-Aldrich/Merck, Дармштадт, Германия	Ф3777	ФИТК-конъюгированный, нет информации о концентрации запасов
Иглы 0,4 мм х 16 мм	BD Microlance, Бектон Диксон, Бектон Дикинсон, Франклин Лейкс, США	No 302200
Неомаунт	Merck, Дармштадт, Германия	HX67590916
Обычная козья сыворотка	Иммуноисследовательские лаборатории Джексона, Уэст-Гроув, США	005-000-121 (Английский
Пенициллин стрептомицин	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США	15140-122
Автоматический дозатор Pipetus	Hirschmann Laborgeräte, Эберштадт, Германия	9907200 (Английский
Крепление ProLong Gold Antifade с DAPI	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США	П36935
кроличий антимышиный Ламинин гамма 1 цепочка	Immundiagnostik, Бенсхайм, Германия	АР1001.1	Нет информации о концентрации запасов
СтемПро Аккутаза	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США	А1105-01
Скальпель для стерильной утилизации (No 15)	MedWare, Неаполь, США	No 120920 (Английский
Шприцы 1 мл	BD Plastipak, Becton Dickinson, Франклин Лейкс, США	303172
Шприцы 10 мл	BD Discardit II, Becton Dickinson, Франклин Лейкс, США	309110 (Английский
Стерильные колбы для клеточных культур T75	Sarstedt AG & Co., Нюмбрехт, Германия	83,39,11,302

) ) ) ) )