Методика конъюгации авидина и биотина для презентации целевых антигенов на БЦЖ Mycobacterium bovis

Аннотация

Источник: Liao, T. A., et al., Экспрессия экзогенных антигенов в вакцине БЦЖ Mycobacterium bovis посредством негенетического украшения поверхности с помощью системы авидин-биотин. J. Vis. Exp. (2018).

Видео демонстрирует технику загрузки антигенов на Mycobacterium bovis BCG для улучшения ее иммуногенных свойств. Метод использует систему авидин-биотин для покрытия бактериальной поверхности экзогенными антигенами.

Протокол

1. Биотинилирование поверхности клетки БЦЖ

1. Выращивайте БЦЖ в бульоне Middlebrook 7H9 с 10% OADC (раствор олеиновой кислоты, альбумина и декстрозы) и 0,05% Tween 80 при 37 °C на платформе шейкера при 50 об/мин до OD = 0,5-1,
   ПРИМЕЧАНИЕ: БЦЖ является патогеном уровня биобезопасности 2, и все эксперименты с БЦЖ должны проводиться в шкафу биобезопасности с надлежащими средствами индивидуальной защиты.
2. Промыть 10⁹ БЦЖ 3 раза с 500 μл ледяного PBS без эндотоксинов плюс 0,1% Tween80 (PBST) (pH 8,0). Суспензируйте гранулы БЦЖ в стерильном PBS, не содержащем эндотоксинов.
3. Непосредственно перед применением приготовьте 1 мл 10 мМ биотина Sulfo-NHS SS в стерильной фильтрованной воде.​
   1. Инкубировать бактерии с 1 мл 0,5 мМ биотина Sulfo-NHS SS при комнатной температуре в течение 30 минут.
4. Промойте меченые бактерии 3 раза 500 мкл холодного ПБСТ для удаления непрореагировавшего реагента биотинилирования.
   1. Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл PBST.

2. Связывание мономерного авидин-фьюжн-белка с биотинилированной поверхностью БЦЖ

1. Смешайте 5 x 10⁸ биотинилированных БЦЖ с Avi-протеином (10 мкг/мл конечного в PBS-T) в течение 1 часа при комнатной температуре на платформе шейкера.
2. Промойте бактерии 3 раза 500 μл холодного PBST.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
RPMI 1640, не содержащий эндотоксинов	Технологии стволовых клеток	No 36750 (Английский
Сульфо-NHS SS биотин	Термо Фишер	No 21328
Бульон Миддлбрук 7H9	Диагностические системы BD	No 271310 (Английский
OADC	Диагностические системы BD	В11886
Подросток 80	Сигма-Олдрич	П1379

) )