Анализ тестового β-глюкана в качестве стратегии иммунотерапии против клеток рака головного мозга

Аннотация

Источник: Folgado-Dorado, C. et al., Выделение и очистка грибкового β-глюкана как стратегия иммунотерапии глиобластомы. J. vis. Exp. (2023)

Это видео демонстрирует анализ in vitro, использующий β-глюканы для активации клеток микроглии для производства супероксидных радикалов, активной формы кислорода. В клетках рака мозга образующиеся реактивные оксиданты активно подавляют пролиферацию опухолевых клеток и вызывают гибель клеток.

Протокол

Исследование in vitro стимуляции микроглии, вызванной β-глюканом

"

1. Клеточная культура клеток глиобластомы и микроглии мыши в предметных стеклах с 8-луночной камерой

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол специфичен для клеточных линий GL261 (глиобластома) и BV2 (микроглия). Тем не менее, с небольшими изменениями, эти шаги потенциально могут быть использованы для изучения других линий раковых и иммунных клеток.

1. Приготовьте модифицированную среду Дульбекко (DMEM) полного цикла, модифицированную L-глутамином, 4,5 г/л D-глюкозы и без пирувата. Добавьте 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин/стрептомицин. Предварительно прогрейте материал на водяной бане при температуре 37 °C в течение 15 минут.
2. Разморозьте замороженные аликвоты BV2 и GL261 на водяной бане (37 °C) в течение 2 минут, а непосредственно перед их полным оттаиванием перенесите их в ламинарный колпак и поместите клетки в две разные стерильные колбы T25 (по одной для каждой клеточной линии).
3. Инкубируйте колбы T25 при температуре 37 °C, 5%_CO2 до тех пор, пока культура не срастет.
   заметка: В зависимости от условий замораживания и времени криоконсервации, время до слияния может варьироваться. Этим клеточным линиям обычно требуется от 3 до 5 дней, чтобы достичь слияния в колбе T75.
4. После того как культура клеток BV2 станет сливающейся, перенесите ее в 8-луночные камерные стекла 0,6 х 10⁶ клеток/лунку. Выдержите предметные стекла с 8 лунками в инкубаторе в течение 24 ч.
5. После того, как клетки микроглии будут помещены в 8-луночные предметные стекла, повторите тот же протокол с клетками GL261.

2. Активация микроглии β-глюканами

1. Покрытие клеток BV2 четырьмя различными β-глюканами (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum и H. erinaceus) в концентрации 0,2 мг/мл в течение 72 ч. Одно экспериментальное состояние должно оставаться нелеченным (нормальная среда), выступая в качестве контрольной группы.
2. Соберите надосадочную жидкость с помощью пипетки через 72 ч и пропустите оставшийся объем через шприцевой фильтр 0,20 мкм. Затем заморозьте надосадочную жидкость при температуре -80 °C не менее чем на 24 часа.

3. Лечение GL261 предварительно активированной средой, кондиционированной микроглией

1. После того как GL261 на 80% конфлюентирует в предметных стеклах 8-луночной камеры, добавьте обработанную β-глюканом микроглиальную среду в конечной объемной концентрации 25% в течение 72 ч (общий объем: 250 мкл/лунка).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
8-луночные камерные слайды	Thermo Fisher, США	171080 Номер 171080
Модифицированная среда Eagle's от Dulbecco, Gluta MAXTM	Gibco, Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США	10564011
Extenda (α-амилаза/глюкоамилаза)	Новозимес, Дания
Фетальная бычья сыворотка	Gibco, Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США	A4736301
Фосфатно-солевой буфер	Gibco, Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США	1010-015
Пенициллин/стрептомицин	Сигма-Олдрич, Сент-Луис	П4458
инкубатор	Эппедорф	Галактика 170С