Метод высокосолевой обработки дендритных клеток и их адоптивного переноса мышам

Аннотация

Источник: Van Beusecum, J. P., et al. Выделение и адоптивный перенос дендритных клеток, обработанных антигенпрезентацией с высоким содержанием соли. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует процедуру адоптивного переноса обработанных солью антигенпрезентирующих дендритных клеток (ДК) мышам. Мышиные CD11c+ дендритные клетки (ДК) подвергаются воздействию среды, содержащей большое количество натрия, образуя в клетках аддукты изолевугландина (IsoLG). Эти аддукты служат неоантигенами и представлены на поверхности ДК. Обработанные солью клетки вводятся мышам путем адоптивного переноса клеток.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Выделение селезенки у мышей

1. Приготовьте 1640 RPMI (Мемориальный институт Розуэлл Парк): 10% фетальная бычья сыворотка (FBS), 0,10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтанасульфоновой кислоты (HEPES), 1 мМ пируват натрия, 50 мкМ β-меркаптоэтанол и 1% пенициллин/стрептомицин.
2. Усыпить 10–12-недельных самцов мышей C57bl/6 путем ингаляции CO₂. Опрыскайте грудь и бока мыши 70% этанолом. С левой стороны осторожно вскройте кожу и брюшную полость, чтобы обнажить селезенку.
3. С помощью небольших щипцов осторожно переместите кишечник и печень на левую сторону мыши, а с помощью тонких ножниц аккуратно иссеките селезенку.
   заметка: Этот шаг нужно делать очень аккуратно, так как повреждение желудочно-кишечного тракта может спровоцировать заражение.
4. Поместите каждую иссеченную селезенку в маркированную коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 3 мл среды RPMI 1640.

2. Генерация суспензий одиночных клеток из селезенки

ПРИМЕЧАНИЕ: Селезенка может быть диссоциирована в одноклеточную суспензию, сочетая механическую диссоциацию плюс ферментативное переваривание.

1. Приготовьте раствор для разложения селезенки, добавив коллагеназу D (1 мг/мл; 0,29 Ед/мг лиофилизированного) и ДНКазу I (0,1 мг/мл) в приготовленную среду RPMI 1640 (см. шаг 1.1)
2. С помощью щипцов перенесите селезенку в С-образную трубку (диссоциационную трубку), содержащую 3 мл раствора для разложения селезенки.
3. Механическую диссоциацию выполнить с помощью полуавтоматического гомогенизатора в соответствии с инструкциями производителя.
   1. Поместите С-образную трубку на полуавтоматический гомогенизатор, убедившись, что С-образная трубка плотно прилегает к вращающемуся рычагу. После установки трубки C нажмите кнопку запуска на полуавтоматическом гомогенизаторе, чтобы запустить протокол Spleen 04.01 в течение 60 с.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Механическую диссоциацию также можно выполнить, поместив фильтр 40 мкм на коническую трубку объемом 50 мл и аккуратно измельчив селезенку через фильтр. После измельчения селезенки через фильтр 40 мкм промыть 10 мл фильтра RPMI.
4. После механической диссоциации отсоедините трубку от гомогенизатора и выполните ферментативное разложение. Инкубируйте образцы в течение 15 минут при температуре 37 °C при непрерывном вращении (20 об/мин).
5. Переведите раствор с помощью пипетирования в коническую пробирку объемом 50 мл после фильтрации через ситечко 40 мкм. Промойте ситечко размером 40 мкм 10 мл PBS Dulbecco's PBS (dPBS). Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C.
6. После центрифугирования полностью аспирируйте надосадочную жидкость и промойте гранулу, повторно суспендируя ее в 10 мл dPBS. Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 минут при 4 °C.

3. Выделение CD11c⁺ DCs из суспензии одиночных клеток селезенки

1. Повторно суспендируйте клеточную таблетку в 5 мл dPBS и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра и исключения трипанового синего.
2. Гранулируйте ячейки центрифугированием при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C.
3. Полностью отасканируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 400 мкл магнитно-активированного буфера для сортировки клеток (MACs).
4. Добавьте 100 мкл микрогранул CD11c (см. Таблицу материалов) на 1 x^{10 8} клеток.
5. Вихревую суспензию клеток и инкубировать в течение 10 мин в холодильнике при температуре 4 °С.
6. Добавьте 10 мл буфера MACs для промывки ячеек. Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 минут при 4 °C.
7. Полностью отасканируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте в 500 мкл буфера MACs.

4. Магнитная сепарация постоянного тока CD11c⁺

ПРИМЕЧАНИЕ: Магнитная сепарация выполняется вручную с помощью магнитного сепаратора (см. Таблицу материалов), оснащенного колоннами LS. Магнитная сепарация также может быть выполнена автоматически с помощью автоматического магнитного сепаратора. (см. Таблицу материалов).

1. Поместите колонку LS в магнитное поле сепаратора MACs и коническую трубку объемом 15 мл под каждой колонной для сбора протока.
2. Промойте колонку LS 3 мл буфера.
3. Поместите суспензию ячеек на каждый столбец LS и соберите сквозной поток, содержащий непомеченные клетки.
4. Промойте колонку LS 3 мл буфера MACs, собирая неразмеченные ячейки, которые проходят через него. Промойте колонку ЛС еще 2 раза.
5. Снимите колонну LS с магнитного сепаратора. Добавьте 5 мл буфера MACs в каждую колонку и немедленно промойте ячейки с магнитной меткой, плотно погрузив колонку LS в чистую коническую пробирку объемом 15 мл.
   заметка: Важно провести двойную изоляцию клеток CD11c для получения клеточной суспензии высокой чистоты. Поэтому повторите шаги с 3.1 по 4.5. и ссылка на рисунок 4 для стандартов чистоты. На этом этапе чистота CD11c⁺ клеток повышается до 90–95%.
6. Определение постоянного токового числа CD11c⁺ на гемоцитометре с помощью исключения трипанового синего цвета. Разведите образец клетки в соотношении 1:1 в 0,4% растворе трипанового синего.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нежизнеспособные клетки будут окрашены в синий цвет, в то время как жизнеспособные клетки останутся неокрашенными.
   1. Для этого нужно аккуратно заполнить гемоцитометр 10 мкл разведения образца клеток и инкубировать в течение 1 минуты.
   2. Подсчитайте ячейки в 4 квадратах размером 1 х 1 мм² в загруженной камере, чтобы определить жизнеспособное количество клеток.

5. Обработка CD11c⁺ DCs in vitro высоким содержанием солей

1. Питательную среду ДК готовят путем добавления 10% FBS, 0,1 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ β-меркаптоэтанола и 1% пенициллина/стрептомицина до 500 мл 1640 RPMI.
2. Приготовьте 10 питательных сред DC с высоким содержанием солей (400 мМ), взвесив 1,17 г NaCl и поместив его в стерильную пробирку для сокола объемом 50 мл. Добавьте 50 мл стерильной среды для клеточных культур DC (приготовленной на шаге 5.1) в 50 мл соколиной пробирки и перемешайте до тех пор, пока NaCl не растворится.
3. Немедленно отфильтруйте питательную среду с высоким содержанием соли DC с помощью вакуумной фильтрации через фильтр 0,2 мкм в колпаке для клеточных культур.
4. Центрифугируйте каждую клеточную суспензию из селезенки при 300 x g в течение 10 мин при 4ºC. Повторно суспендируйте каждую клеточную гранулу в питательных средах DC в концентрации 1 x 10⁶ клеток/мл.
5. Пипетка 900 мкл (приблизительно 1 x 10⁶ ячеек) суспензии постоянного тока в 24-луночном планшете Falcon с плоским дном. Добавьте 100 мкл питательной среды DC с высоким содержанием соли в каждую лунку для получения конечной концентрации натрия 190 мМ. Наклейте этикетку на планшет и поместите в инкубатор с увлажненным CO₂ при температуре 37 °C на 48 часов.

6. Адоптивный перенос обработанных солью CD11c⁺ DC

1. После стимуляции in vitro в течение 48 ч извлеките планшет из увлажненного_{CO2-инкубатора} при температуре 37 °C.
2. Пипетируйте питательную среду для клеточных культур вверх и вниз для ресуспендирования CD11c⁺ DCs. Пипетируйте всю суспензию CD11c⁺ DC в соответствующую пробирку объемом 1,6 мл. Повторите этот шаг для каждого отдельного хорошо покрытого слоя.
3. Центрифугируйте каждую суспензию CD11c⁺ DC при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулу DC 100 μл стерильного dPBS.
4. Наберите суспензию DC в шприц объемом 1 мл, оснащенный иглой 27 G 1/2 дюйма.
5. Поместите наивного самца 10-недельных мышей C57bl/6 под 2% изофлурана для достижения стабильной хирургической плоскости. Проверьте уровень анестезии при отсутствии педального рефлекса. Как только будет достигнута стабильная операционная плоскость, медленно и осторожно вводите иглу в ретроорбитальное пространство под углом примерно 30°,<бр/> заметка: Скос иглы 27 G должен быть направлен вниз, в сторону от глаза, чтобы предотвратить повреждение глаз.
6. Медленно и плавно вводите суспензию CD11c⁺ DC (примерно 1 x 10⁶ клеток). После завершения инъекции осторожно извлеките иглу из ретроорбитального пространства, стараясь не повредить глаз.
   заметка: После инъекции кровотечение должно быть незначительным или отсутствовать. Адоптивный перенос CD11c⁺ ДК также может быть выполнен с использованием внутривенного метода инъекции (например, через хвостовую вену). Контрольные мыши получали CD11c⁺ DCs, которые культивировали в обычных солевых средах.
7. Извлеките мышей из носового конуса и наблюдайте за ними в течение примерно 30 минут во время восстановления после анестезии.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
APC/Cy7 антимышь CD11c	Биолегенда	117324
Бегущий буфер autoMACS	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-091-221
CD11c Микрогранулы сверхчистые	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-108-338
Коллагеназа D	Рош	11088866001
ДНКаза I	Рош	10104159001
dPBS без кальция и магния	Корнинг	21-031-ЧВ
Блокирующий реагент FcR	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-092-575
Антимышь FITC CD45	Биолегенда	103108
Трубка GentleMACS C	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-096-334
Диссоциатор GentleMACS	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-093-235	Протокол использования: Селезенка 04.01
LIVE/DEAD исправляемый набор для окрашивания фиолетовых мертвых клеток	Инвитроген	Л34964
Колонны LS	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-042-401
Сеператор QuadroMACs	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-090-976
RPMI 1640 средний	Gibco	11835-030