Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Проектирование и обслуживание клеточных линий NIT-1
- Поддерживайте клеточные линии NIT-1, которые имеют общий генетический фон с мышами без ожирения (NOD), и клетки 293FT в чашках, обработанных культурой тканей, в модифицированной среде Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), содержащей 4,5 г/л глюкозы с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2.
- Вырастите клетки 293FT до 70%-80% слияния для трансфекции.
- На 10-сантиметровую чашку с клетками размером 293 фута соедините 10 мкг pLenti-luciferase-blast (см. Дополнительный файл 1), который экспрессирует трансген люциферазы светлячка (luc2) под контролем конститутивно активного промотора EF1α, по 2 мкг каждой из упаковочных плазмид pMD2.G, pMDLg/pRRE и pRSV-Rev, 4 мкг плазмиды белка оболочки pCMV-VSV-G, и 60 мкг линейного полиэтиленимина (ПЭИ) в 1 мл бессывороточного DMEM. Отрегулируйте количество клеток в зависимости от количества клеток, которые необходимо трансфицировать.
- Оставьте ДНК, ПЭИ и ДПМ при комнатной температуре (RT) на 20 минут, а затем добавьте их к клеткам размером 293 фута.
- Соберите среду, содержащую частицы лентивируса, через 48 ч после трансфекции.
- Трансдуцировать клетки NIT-1 при конфлюенции ~80% с 1 мл среды, содержащей лентивирусные частицы, на 106 клеток в течение 48-72 ч.
- Отбирайте клетки, экспрессирующие люциферазу, с 5 мкг/мл бластицидина в течение 48 ч.
- Кроме того, генетически модифицировать клетки, экспрессирующие люциферазу, в соответствии с экспериментальным вопросом. Для сравнения включите экспрессирующую люциферазу контрольную клеточную линию дикого типа или нецелевую контрольную клеточную линию.
заметка: Примеры модификаций генов-мишеней включают кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR), нокаут CRISPRa/i, нокдаун шРНК и сверхэкспрессию.
2. Подготовка клеток NIT-1 к трансплантации
- Выращивайте клетки, экспрессирующие люциферазу, до тех пор, пока они не станут на 80%-90% сливающимися.
- Удалите питательную среду и промойте клетки фосфатно-солевым раствором (PBS, 5 мл на чашку 10 см).
- Добавьте 1 мл 0,05% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (трипсин-ЭДТА) в каждую посуду на 2 мин.
- Нейтрализуйте трипсин 5 мл питательной среды.
- С помощью пипетки смойте клетки с чашки и перенесите их в коническую трубку.
заметка: Клетки из нескольких чашек одной клеточной линии могут быть объединены.
- Подсчитайте клетки с помощью морилки, такой как трипановый синий, вручную с помощью гемоцитометра или автоматически с помощью автоматического счетчика клеток.
- Центрифугируйте при 250 × г в течение 5 мин при RT и удалите надосадочную жидкость с помощью аспирационной пипетки.
- Ресуспендируйте клеточную таблетку в PBS в концентрации 5 × 107 клеток/мл (107 клеток на клеточную линию на одну мышь будут трансплантированы в объеме 200 μл).
- Держите клетки на льду (до 3 часов) до трансплантации.
3. Трансплантация клеток NIT-1 мышам без ожирения с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (NOD-scid)
- Обезболите мышей-реципиентов (8-10-недельных мышей NOD-scid того же пола, что и мыши, используемые для выделения спленоцитов) путем ингаляции изофлурана в нокдаун-камере. Подайте 2,5% изофлуран в камеру со скоростью потока 1,5 л/мин и скоростью вакуумирования 9 л/мин.
- Смажьте глаза животного офтальмологической мазью, чтобы предотвратить пересыхание.
- С помощью электробритвы с защитным кожухом удалите шерсть со спины (спинной стороны) мышей, чтобы обнажить кожу. Площадь выбритой трансплантата будет примерно 1 дюйм х 2 дюйма. Верните бритых мышей в нокдаун-камеру до пересадки.
- Перекладывайте мышей по одной на чистую поверхность с помощью изофлуранового носового конуса. Аккуратно направьте голову мыши в носовой обтекатель. Используйте скорость потока изофлурана 0,25 л/мин для поддержания анестезии во время трансплантации.
- Протрите место пересадки пластырем с помощью изопропилового спирта, чтобы удалить выпавшие волосы и продезинфицировать кожу.
- Перед загрузкой шприца убедитесь, что ячейки полностью подвешены. Наберите избыточный объем (>300 мкл) клеток в стерильный шприц объемом 1 мл иглой 26 G. Удалите все пузыри; затем верните лишние клетки в пробирку так, чтобы в шприце осталось 300 мкл клеточной суспензии.
- С помощью пары изогнутых щипцов, удерживаемых в недоминантной руке, аккуратно приподнимите кожу с одной стороны (слева или справа) спины мыши, чтобы обеспечить более легкий доступ к подкожному пространству.
- Используя доминирующую руку, расположите шприц параллельно корональной и сагиттальной плоскостям тела мыши. Направив иглу к голове мыши, введите иглу в кожу возле задних конечностей и аккуратно направьте ее в подкожное пространство. Следите за тем, чтобы вся игла оставалась под кожей и не протыкалась насквозь.
- Отрегулируйте щипцы, чтобы аккуратно удерживать кожу вокруг основания иглы. Медленно дозируйте небольшое количество клеточной суспензии (<50 μл) и убедитесь, что под кожей в месте инъекции образуется небольшая выпуклость. Продолжайте вводить клеточную суспензию до тех пор, пока 200 мкл не будет доставлено в подкожное пространство.
- Удерживая щипцы на месте и держа иглу параллельно телу мыши, медленно извлекайте иглу. После того, как игла будет удалена, удерживайте кожу щипцами в течение нескольких секунд, чтобы предотвратить вытекание клеток из колотой раны.
- Если проводится оценка генетической модификации, повторите трансплантацию на противоположной стороне мыши с использованием другого шприца, чтобы в каждую мышь были введены как мутантные, так и контрольные клетки, причем одна клеточная линия находится слева, а другая справа. Если трансплантируется только одна клеточная линия, вводите клетки только с одной стороны.
- После пересадки пересадите каждую мышь в новую клетку. Дайте каждой мыши полностью восстановиться после анестезии, прежде чем добавлять в клетку дополнительных мышей.
заметка: Мыши выздоравливают, когда они возвращаются к нормальной деятельности и не проявляют признаков вялости или нарушения движения.
- Ежедневно оценивайте состояние здоровья мышей в течение всего эксперимента после трансплантации. Если трансплантаты образуют большую выпуклость или мыши становятся слабыми и вялыми, измерьте уровень глюкозы в крови и обеспечьте всех мышей с гипогликемией 10% сахарозной воды в недопустимом количестве. Следуйте всем ветеринарным рекомендациям и усыпляйте любых мышей с продолжающимся плохим состоянием тела в соответствии с рекомендациями учреждения. В этом исследовании мышей усыпляли путем ингаляции CO2 с последующим вывихом шейки матки.
4. Выделение и очистка аутореактивных спленоцитов
- Определите 10-16-недельных самцов или самок мышей NOD с недавно возникшим (менее 10 дней) диабетом с помощью тест-полосок для определения уровня глюкозы в моче (или крови). Мыши с NOD считаются диабетиками, если у них уровень глюкозы в моче/крови ≥250 мг/дл в течение как минимум 2 дней подряд.
заметка: Для каждой мыши NOD-scid необходимо 10 миллионов спленоцитов; Из одной селезенки обычно получается от 50 до 150 миллионов спленоцитов. Спленоциты были выделены от мышей без патогенов, содержащихся в помещении под наблюдением часов.
- Усыпьте соответствующее количество мышей с диабетическим NOD.
заметка: В этом исследовании мышей усыпляли путем вдыханияCO2 с последующим вывихом шейки матки, чтобы обеспечить смерть.
- Положив мышь на спину, сделайте вертикальный разрез примерно 2 дюйма в длину кожи хирургическими ножницами. Откройте правую сторону мыши с точки зрения исследователя и найдите ярко-красную селезенку. Аккуратно отрежьте селезенку от розовой поджелудочной железы и перенесите ее в стерильную чашку Петри диаметром 10 см, содержащую 5 мл стерильного PBS. Повторите вскрытие с таким количеством мышей, которое необходимо.
заметка: Селезенку от нескольких мышей можно объединить в одном блюде. Проведите следующие действия, используя стерильные реагенты и оборудование в стерильном колпаке.
- Разомните селезенку (селезенки) плоской верхней частью стерильного поршня шприца.
- Поместите ситечко размером 40 мкм или 70 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл и промойте ситечко 5 мл PBS, чтобы заправить его. Перелейте суспензию селезенки в ситечко и продолжайте осторожное разминание через ситечко. Вымойте посуду 10 мл PBS и переложите средство для мытья в ситечко. Продолжайте разминать до тех пор, пока красный цвет не исчезнет с ситечка.
- Выбросьте фильтр и вращайте пробирку при температуре 500 × г в течение 5 минут при RT. Удалите надосадочную жидкость с помощью аспирационной пипетки.
- Суспендируйте клеточную гранулу в 5 мл (до трех селезенок) буфера для лизиса ACK, предварительно подогретого до ЛТ, и лизируйте эритроциты в течение 4 мин. Увеличьте объем на 1-2 мл на селезенку, если требуется дополнительная селезенка.
- Остановите реакцию 5 мл клеточной среды NIT-1 (описанной выше) на 5 мл буфера для лизиса. Пропустите клеточную суспензию через свежее ситечко, чтобы удалить комки. Выбросьте ситечко и вращайте при 500 × г в течение 5 минут при RT.
- Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 20 мл PBS и подсчитайте клетки. Вращайте при 500 × г в течение 5 мин при РТ. Ресуспендируйте клетки в стерильном PBS в концентрации 1 ×10 8 клеток/мл (объем инъекции 0,1 мл/мышь) в реакционной пробирке объемом 1,5 мл с безопасным замком.
- Храните клетки на льду (не более 1 ч) или держите клетки при ЛТ, а затем немедленно приступайте к инъекции в хвостовую вену.
5. Внутривенное введение диабетических спленоцитов через боковую хвостовую вену
- Разогрейте тело взрослых мышей-реципиентов NOD-scid (например, используя тепловую лампу в течение ~5-10 минут) для расширения вен (это помогает для визуализации и введения в вену).
заметка: Чтобы избежать перегрева мышей, не превышайте это время. Всегда следите за состоянием здоровья. Если мыши выглядят истощенными или неподвижными, немедленно выключите тепловую лампу.
- Прогрейте клеточную суспензию. Приготовьте стерильный шприц (0,3-1,0 мл) со стерильной иглой (27-30 г, 0,3 мм/0,5 дюйма или меньше) или используйте стерильный инсулиновый шприц 0,5 мл с иглой 0,3 мм (0,5 дюйма). Всегда держите иглу стерильной и используйте стерильный капу, если шприц необходимо опустить между инъекциями.
- Повторно суспендируйте раствор спленоцитов перед каждой инъекцией. На каждую мышь наберите в шприц по 100 мкл предварительно подогретой и смешанной суспензии спленоцитов. Следите за тем, чтобы в шприце или в суспензии не присутствовали пузырьки воздуха.
заметка: Перед тем как поместить мышь в удерживающее устройство, убедитесь, что у вас есть все необходимое оборудование и принадлежности (спиртовые салфетки для дезинфекции, шприц с вводимыми спленоцитами, а также свежая клетка для отделения инъекционных мышей).
- Поместите мышь в удерживающее устройство. Захватите хвост недоминирующей рукой и найдите одну из двух боковых хвостовых вен. При необходимости аккуратно поверните хвост. Протрите хвост дезинфицирующей салфеткой (70% изопропилового спирта), чтобы очистить кожу и увеличить видимость вены.
- Введите иглу под острым углом в центральную область хвоста доминирующей рукой. Скосом иглы вверх проведите иглой на несколько миллиметров по коже.
заметка: Убедитесь, что игла параллельна вене и расположена немного под кожей. Будьте готовы к резким движениям мыши/хвоста сразу после проникновения в стенку кожи/сосуда. Успешное введение иглы должно ощущаться как «плавное скольжение» в вену. Если требуется еще одна попытка, двигайтесь дальше вверх по хвосту к телу.
- Слегка надавите на шприц, чтобы ввести суспензию спленоцитов. Не позволяйте игле двигаться дальше внутрь или наружу во время инъекции. Успешные инъекции проходят гладко, без ощущения обратного давления во время инъекции и проявляются в виде прозрачного/белого кровотока сразу после инъекции.
- Аккуратно выпустите иглу из вены и слегка надавите на хвост дезинфицирующей салфеткой до тех пор, пока кровотечение не остановится. Освободите мышь от удерживающего устройства и аккуратно переложите ее в только что подготовленную клетку.
заметка: Введите двух-трех контрольных мышей, которые не получают трансплантат клеток NIT-1, со спленоцитами, чтобы подтвердить способность аутореактивных спленоцитов вызывать диабет, что занимает примерно 2-4 недели после инъекции.
6. Биолюминесцентная визуализация трансплантатов NIT-1 in vivo
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализируйте графты один-два раза в неделю. В день трансплантации подождите не менее 2 часов после трансплантации, чтобы позволить трансплантатам прижиться и обеспечить стабильную экспрессию люциферазы. Если время является ограничивающим фактором, то первоначальное измерение можно провести в день 1. Рекомендуемый график первичной визуализации: день 0 или день 1 после инъекции, день 5, день 10, день 14, день 18 и день 25. Однако скорректируйте график в зависимости от развития аутоиммунитета, о котором можно судить по потере биолюминесцентного сигнала.
- Приготовьте раствор D-люциферина в концентрации 15 мг/мл в PBS Dulbecco. Перемешайте при RT до растворения и стерильном фильтре (0,22 мкм). Храните 1 мл аликвот при температуре −20 °C и размораживайте по мере необходимости.
заметка: Аликвоты можно повторно заморозить.
- Не менее чем за 5 минут до визуализации введите мышам внутрибрюшинно с помощью шприца объемом 1 мл и иглы 26 г раствор D-люциферина в дозе 150 мг/кг. <бр/>
заметка: Используйте свежий шприц и иглу для каждой мыши.
- Обезболивайте мышей путем ингаляции изофлурана в соответствии с рекомендациями учреждения. Рекомендуемые условия - 2,5% изофлуран со скоростью потока 1,5 л/мин в камеру сброса и скоростью вакуумирования 9 л/мин.
- Смажьте глаза животного офтальмологической мазью, чтобы предотвратить пересыхание.
- Откройте программное обеспечение, связанное с устройством обработки изображений. Создайте нового пользователя и/или логин. На панели управления в правом нижнем углу выберите «Инициализация» (рис. 1A). Чтобы автоматически сохранить данные изображения, создайте соответствующие папки на компьютере, а затем выберите Съемка | Автосохранение в... (Рисунок 1A). После того, как прибор завершит инициализацию, установите время экспозиции на 1 мин.
заметка: Полные параметры визуализации показаны на рисунке 1B.
- Переносите мышей по одной из нокдаун-камеры в прибор для визуализации. Положите мышь на живот, расставив конечности, и осторожно направьте ее голову в носовой конус. Скорость потока изофлурана 0,25 л/мин, подаваемого через носовой конус, является подходящей для поддержания анестезии во время визуализации. Аккуратно расплющите мышь, надавливая обеими руками на центр ее задней части, а затем разводя руки наружу и в стороны.
- Выберите Acquire (рис. 1B). Запишите все важные детали эксперимента во всплывающем окне (рисунок 1C).
заметка: На рисунке 2A приведены репрезентативные изображения трех 8-недельных самок мышей с NOD-scid, которым были пересажены два трансплантата в разные моменты времени.
