Визуализация трансгенных бета-клеток у иммунодефицитной мыши с диабетическими спленоцитами

Аннотация

Источник: Стюарт, Т. и др., Биолюминесцентный мониторинг выживаемости трансплантата в модели адоптивного переноса аутоиммунного диабета у мышей.J. Vis. Exp. (2022)

Это видео демонстрирует основанный на визуализации метод визуализации трансплантированных бета-клеток, экспрессирующих люциферазу, у мыши с диабетическим иммунодефицитом, не страдающей ожирением. Введение спленоцитов от мышей с диабетом приводит к прогрессирующему разрушению бета-клеток, что визуально подтверждается снижением люминесценции после введения субстрата.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Проектирование и обслуживание клеточных линий NIT-1

1. Поддерживайте клеточные линии NIT-1, которые имеют общий генетический фон с мышами без ожирения (NOD), и клетки 293FT в чашках, обработанных культурой тканей, в модифицированной среде Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), содержащей 4,5 г/л глюкозы с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2.
2. Вырастите клетки 293FT до 70%-80% слияния для трансфекции.
3. На 10-сантиметровую чашку с клетками размером 293 фута соедините 10 мкг pLenti-luciferase-blast (см. Дополнительный файл 1), который экспрессирует трансген люциферазы светлячка (luc2) под контролем конститутивно активного промотора EF1α, по 2 мкг каждой из упаковочных плазмид pMD2.G, pMDLg/pRRE и pRSV-Rev, 4 мкг плазмиды белка оболочки pCMV-VSV-G, и 60 мкг линейного полиэтиленимина (ПЭИ) в 1 мл бессывороточного DMEM. Отрегулируйте количество клеток в зависимости от количества клеток, которые необходимо трансфицировать.
4. Оставьте ДНК, ПЭИ и ДПМ при комнатной температуре (RT) на 20 минут, а затем добавьте их к клеткам размером 293 фута.
5. Соберите среду, содержащую частицы лентивируса, через 48 ч после трансфекции.
6. Трансдуцировать клетки NIT-1 при конфлюенции ~80% с 1 мл среды, содержащей лентивирусные частицы, на 10⁶ клеток в течение 48-72 ч.
7. Отбирайте клетки, экспрессирующие люциферазу, с 5 мкг/мл бластицидина в течение 48 ч.
8. Кроме того, генетически модифицировать клетки, экспрессирующие люциферазу, в соответствии с экспериментальным вопросом. Для сравнения включите экспрессирующую люциферазу контрольную клеточную линию дикого типа или нецелевую контрольную клеточную линию.
   заметка: Примеры модификаций генов-мишеней включают кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR), нокаут CRISPRa/i, нокдаун шРНК и сверхэкспрессию.

2. Подготовка клеток NIT-1 к трансплантации

1. Выращивайте клетки, экспрессирующие люциферазу, до тех пор, пока они не станут на 80%-90% сливающимися.
2. Удалите питательную среду и промойте клетки фосфатно-солевым раствором (PBS, 5 мл на чашку 10 см).
3. Добавьте 1 мл 0,05% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (трипсин-ЭДТА) в каждую посуду на 2 мин.
4. Нейтрализуйте трипсин 5 мл питательной среды.
5. С помощью пипетки смойте клетки с чашки и перенесите их в коническую трубку.
   заметка: Клетки из нескольких чашек одной клеточной линии могут быть объединены.
6. Подсчитайте клетки с помощью морилки, такой как трипановый синий, вручную с помощью гемоцитометра или автоматически с помощью автоматического счетчика клеток.
7. Центрифугируйте при 250 × г в течение 5 мин при RT и удалите надосадочную жидкость с помощью аспирационной пипетки.
8. Ресуспендируйте клеточную таблетку в PBS в концентрации 5 × 10⁷ клеток/мл (10⁷ клеток на клеточную линию на одну мышь будут трансплантированы в объеме 200 μл).
9. Держите клетки на льду (до 3 часов) до трансплантации.

3. Трансплантация клеток NIT-1 мышам без ожирения с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (NOD-scid)

1. Обезболите мышей-реципиентов (8-10-недельных мышей NOD-scid того же пола, что и мыши, используемые для выделения спленоцитов) путем ингаляции изофлурана в нокдаун-камере. Подайте 2,5% изофлуран в камеру со скоростью потока 1,5 л/мин и скоростью вакуумирования 9 л/мин.
2. Смажьте глаза животного офтальмологической мазью, чтобы предотвратить пересыхание.
3. С помощью электробритвы с защитным кожухом удалите шерсть со спины (спинной стороны) мышей, чтобы обнажить кожу. Площадь выбритой трансплантата будет примерно 1 дюйм х 2 дюйма. Верните бритых мышей в нокдаун-камеру до пересадки.
4. Перекладывайте мышей по одной на чистую поверхность с помощью изофлуранового носового конуса. Аккуратно направьте голову мыши в носовой обтекатель. Используйте скорость потока изофлурана 0,25 л/мин для поддержания анестезии во время трансплантации.
5. Протрите место пересадки пластырем с помощью изопропилового спирта, чтобы удалить выпавшие волосы и продезинфицировать кожу.
6. Перед загрузкой шприца убедитесь, что ячейки полностью подвешены. Наберите избыточный объем (>300 мкл) клеток в стерильный шприц объемом 1 мл иглой 26 G. Удалите все пузыри; затем верните лишние клетки в пробирку так, чтобы в шприце осталось 300 мкл клеточной суспензии.
7. С помощью пары изогнутых щипцов, удерживаемых в недоминантной руке, аккуратно приподнимите кожу с одной стороны (слева или справа) спины мыши, чтобы обеспечить более легкий доступ к подкожному пространству.
8. Используя доминирующую руку, расположите шприц параллельно корональной и сагиттальной плоскостям тела мыши. Направив иглу к голове мыши, введите иглу в кожу возле задних конечностей и аккуратно направьте ее в подкожное пространство. Следите за тем, чтобы вся игла оставалась под кожей и не протыкалась насквозь.
9. Отрегулируйте щипцы, чтобы аккуратно удерживать кожу вокруг основания иглы. Медленно дозируйте небольшое количество клеточной суспензии (<50 μл) и убедитесь, что под кожей в месте инъекции образуется небольшая выпуклость. Продолжайте вводить клеточную суспензию до тех пор, пока 200 мкл не будет доставлено в подкожное пространство.
10. Удерживая щипцы на месте и держа иглу параллельно телу мыши, медленно извлекайте иглу. После того, как игла будет удалена, удерживайте кожу щипцами в течение нескольких секунд, чтобы предотвратить вытекание клеток из колотой раны.
11. Если проводится оценка генетической модификации, повторите трансплантацию на противоположной стороне мыши с использованием другого шприца, чтобы в каждую мышь были введены как мутантные, так и контрольные клетки, причем одна клеточная линия находится слева, а другая справа. Если трансплантируется только одна клеточная линия, вводите клетки только с одной стороны.
12. После пересадки пересадите каждую мышь в новую клетку. Дайте каждой мыши полностью восстановиться после анестезии, прежде чем добавлять в клетку дополнительных мышей.
    заметка: Мыши выздоравливают, когда они возвращаются к нормальной деятельности и не проявляют признаков вялости или нарушения движения.
13. Ежедневно оценивайте состояние здоровья мышей в течение всего эксперимента после трансплантации. Если трансплантаты образуют большую выпуклость или мыши становятся слабыми и вялыми, измерьте уровень глюкозы в крови и обеспечьте всех мышей с гипогликемией 10% сахарозной воды в недопустимом количестве. Следуйте всем ветеринарным рекомендациям и усыпляйте любых мышей с продолжающимся плохим состоянием тела в соответствии с рекомендациями учреждения. В этом исследовании мышей усыпляли путем ингаляции CO₂ с последующим вывихом шейки матки.

4. Выделение и очистка аутореактивных спленоцитов

1. Определите 10-16-недельных самцов или самок мышей NOD с недавно возникшим (менее 10 дней) диабетом с помощью тест-полосок для определения уровня глюкозы в моче (или крови). Мыши с NOD считаются диабетиками, если у них уровень глюкозы в моче/крови ≥250 мг/дл в течение как минимум 2 дней подряд.
   заметка: Для каждой мыши NOD-scid необходимо 10 миллионов спленоцитов; Из одной селезенки обычно получается от 50 до 150 миллионов спленоцитов. Спленоциты были выделены от мышей без патогенов, содержащихся в помещении под наблюдением часов.
2. Усыпьте соответствующее количество мышей с диабетическим NOD.
   заметка: В этом исследовании мышей усыпляли путем вдыхания_CO2 с последующим вывихом шейки матки, чтобы обеспечить смерть.
3. Положив мышь на спину, сделайте вертикальный разрез примерно 2 дюйма в длину кожи хирургическими ножницами. Откройте правую сторону мыши с точки зрения исследователя и найдите ярко-красную селезенку. Аккуратно отрежьте селезенку от розовой поджелудочной железы и перенесите ее в стерильную чашку Петри диаметром 10 см, содержащую 5 мл стерильного PBS. Повторите вскрытие с таким количеством мышей, которое необходимо.
   заметка: Селезенку от нескольких мышей можно объединить в одном блюде. Проведите следующие действия, используя стерильные реагенты и оборудование в стерильном колпаке.
4. Разомните селезенку (селезенки) плоской верхней частью стерильного поршня шприца.
5. Поместите ситечко размером 40 мкм или 70 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл и промойте ситечко 5 мл PBS, чтобы заправить его. Перелейте суспензию селезенки в ситечко и продолжайте осторожное разминание через ситечко. Вымойте посуду 10 мл PBS и переложите средство для мытья в ситечко. Продолжайте разминать до тех пор, пока красный цвет не исчезнет с ситечка.
6. Выбросьте фильтр и вращайте пробирку при температуре 500 × г в течение 5 минут при RT. Удалите надосадочную жидкость с помощью аспирационной пипетки.
7. Суспендируйте клеточную гранулу в 5 мл (до трех селезенок) буфера для лизиса ACK, предварительно подогретого до ЛТ, и лизируйте эритроциты в течение 4 мин. Увеличьте объем на 1-2 мл на селезенку, если требуется дополнительная селезенка.
8. Остановите реакцию 5 мл клеточной среды NIT-1 (описанной выше) на 5 мл буфера для лизиса. Пропустите клеточную суспензию через свежее ситечко, чтобы удалить комки. Выбросьте ситечко и вращайте при 500 × г в течение 5 минут при RT.
9. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 20 мл PBS и подсчитайте клетки. Вращайте при 500 × г в течение 5 мин при РТ. Ресуспендируйте клетки в стерильном PBS в концентрации 1 ×^{10 8} клеток/мл (объем инъекции 0,1 мл/мышь) в реакционной пробирке объемом 1,5 мл с безопасным замком.
10. Храните клетки на льду (не более 1 ч) или держите клетки при ЛТ, а затем немедленно приступайте к инъекции в хвостовую вену.

5. Внутривенное введение диабетических спленоцитов через боковую хвостовую вену

1. Разогрейте тело взрослых мышей-реципиентов NOD-scid (например, используя тепловую лампу в течение ~5-10 минут) для расширения вен (это помогает для визуализации и введения в вену).
   заметка: Чтобы избежать перегрева мышей, не превышайте это время. Всегда следите за состоянием здоровья. Если мыши выглядят истощенными или неподвижными, немедленно выключите тепловую лампу.
2. Прогрейте клеточную суспензию. Приготовьте стерильный шприц (0,3-1,0 мл) со стерильной иглой (27-30 г, 0,3 мм/0,5 дюйма или меньше) или используйте стерильный инсулиновый шприц 0,5 мл с иглой 0,3 мм (0,5 дюйма). Всегда держите иглу стерильной и используйте стерильный капу, если шприц необходимо опустить между инъекциями.
3. Повторно суспендируйте раствор спленоцитов перед каждой инъекцией. На каждую мышь наберите в шприц по 100 мкл предварительно подогретой и смешанной суспензии спленоцитов. Следите за тем, чтобы в шприце или в суспензии не присутствовали пузырьки воздуха.
   заметка: Перед тем как поместить мышь в удерживающее устройство, убедитесь, что у вас есть все необходимое оборудование и принадлежности (спиртовые салфетки для дезинфекции, шприц с вводимыми спленоцитами, а также свежая клетка для отделения инъекционных мышей).
4. Поместите мышь в удерживающее устройство. Захватите хвост недоминирующей рукой и найдите одну из двух боковых хвостовых вен. При необходимости аккуратно поверните хвост. Протрите хвост дезинфицирующей салфеткой (70% изопропилового спирта), чтобы очистить кожу и увеличить видимость вены.
5. Введите иглу под острым углом в центральную область хвоста доминирующей рукой. Скосом иглы вверх проведите иглой на несколько миллиметров по коже.
   заметка: Убедитесь, что игла параллельна вене и расположена немного под кожей. Будьте готовы к резким движениям мыши/хвоста сразу после проникновения в стенку кожи/сосуда. Успешное введение иглы должно ощущаться как «плавное скольжение» в вену. Если требуется еще одна попытка, двигайтесь дальше вверх по хвосту к телу.
6. Слегка надавите на шприц, чтобы ввести суспензию спленоцитов. Не позволяйте игле двигаться дальше внутрь или наружу во время инъекции. Успешные инъекции проходят гладко, без ощущения обратного давления во время инъекции и проявляются в виде прозрачного/белого кровотока сразу после инъекции.
7. Аккуратно выпустите иглу из вены и слегка надавите на хвост дезинфицирующей салфеткой до тех пор, пока кровотечение не остановится. Освободите мышь от удерживающего устройства и аккуратно переложите ее в только что подготовленную клетку.
   заметка: Введите двух-трех контрольных мышей, которые не получают трансплантат клеток NIT-1, со спленоцитами, чтобы подтвердить способность аутореактивных спленоцитов вызывать диабет, что занимает примерно 2-4 недели после инъекции.

6. Биолюминесцентная визуализация трансплантатов NIT-1 in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализируйте графты один-два раза в неделю. В день трансплантации подождите не менее 2 часов после трансплантации, чтобы позволить трансплантатам прижиться и обеспечить стабильную экспрессию люциферазы. Если время является ограничивающим фактором, то первоначальное измерение можно провести в день 1. Рекомендуемый график первичной визуализации: день 0 или день 1 после инъекции, день 5, день 10, день 14, день 18 и день 25. Однако скорректируйте график в зависимости от развития аутоиммунитета, о котором можно судить по потере биолюминесцентного сигнала.

1. Приготовьте раствор D-люциферина в концентрации 15 мг/мл в PBS Dulbecco. Перемешайте при RT до растворения и стерильном фильтре (0,22 мкм). Храните 1 мл аликвот при температуре −20 °C и размораживайте по мере необходимости.
   заметка: Аликвоты можно повторно заморозить.
2. Не менее чем за 5 минут до визуализации введите мышам внутрибрюшинно с помощью шприца объемом 1 мл и иглы 26 г раствор D-люциферина в дозе 150 мг/кг. <бр/> заметка: Используйте свежий шприц и иглу для каждой мыши.
3. Обезболивайте мышей путем ингаляции изофлурана в соответствии с рекомендациями учреждения. Рекомендуемые условия - 2,5% изофлуран со скоростью потока 1,5 л/мин в камеру сброса и скоростью вакуумирования 9 л/мин.
4. Смажьте глаза животного офтальмологической мазью, чтобы предотвратить пересыхание.
5. Откройте программное обеспечение, связанное с устройством обработки изображений. Создайте нового пользователя и/или логин. На панели управления в правом нижнем углу выберите «Инициализация» (рис. 1A). Чтобы автоматически сохранить данные изображения, создайте соответствующие папки на компьютере, а затем выберите Съемка | Автосохранение в... (Рисунок 1A). После того, как прибор завершит инициализацию, установите время экспозиции на 1 мин.
   заметка: Полные параметры визуализации показаны на рисунке 1B.
6. Переносите мышей по одной из нокдаун-камеры в прибор для визуализации. Положите мышь на живот, расставив конечности, и осторожно направьте ее голову в носовой конус. Скорость потока изофлурана 0,25 л/мин, подаваемого через носовой конус, является подходящей для поддержания анестезии во время визуализации. Аккуратно расплющите мышь, надавливая обеими руками на центр ее задней части, а затем разводя руки наружу и в стороны.
7. Выберите Acquire (рис. 1B). Запишите все важные детали эксперимента во всплывающем окне (рисунок 1C).
   заметка: На рисунке 2A приведены репрезентативные изображения трех 8-недельных самок мышей с NOD-scid, которым были пересажены два трансплантата в разные моменты времени.

Результаты

Рисунок 1: Скриншоты команд программного обеспечения для визуализации биолюминесцентных трансплантатов. (A) Перед созданием образа выберите Initialize (Инициализация), чтобы подготовить инструмент. Изображения могут быть автоматически сохранены в папке по выбору, выбрав Acquisition | Автосохранение в... (B) Обзор пар...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,05% трипсин, 0,53 мМ ЭДТА	Корнинг	25-052-КИ
293ФУТ	Инвитроген	Р70007	Быстрорастущий, высокотрансфицируемый клональный изолят, полученный из эмбриональных клеток почек человека, трансформированных большим Т-антигеном SV40
Лизирующий буфер ACK	Gibco	А10492-01
Спиртовые подушечки, 70% изопропиловый спирт	Amazon/Всегда готовая первая помощь	B08NWF31DX
BD 5мл Шприц с наконечником Luer-Lok	БД	309646
Игла BD PrecisionGlide 26G x 5/8 (0,45 мм x 16 мм) Sub-Q	БД	305115
BD 1 мл TB Шприц с скользящим наконечником	БД	309659
Бластицидин S HCl	Корнинг	30-100-РБ
Клеточный фильтр премиум SureStrain, 70 мкм, стерильный	Южная лабораторная посуда	С4070	Или используйте аналогичное стерильное ситечко с размером пор 40-70 мкм
Автоматический счетчик ячеек CellDrop	Деновикс	СеллДроп BF-PAYG	Или используйте аналогичное устройство для подсчета ячеек
Corning 100 мл раствора пенициллин-стрептомицина, 100x	Корнинг	30-002-КИ
Одноразовые аспирационные пипетки, полистирол, стерильные, емкость=2 мл	ВВР	414004-265	Или используйте аналогичную аспирационную пипетку
D-люциферин, соль калия, класс молекулярной биологии, порошок, >99%	Голдбио	ЛАК-100
ДМЭМ, высокий уровень глюкозы, пируват, без глутамина	Gibco	10313039
Пробирки Falcon BD, 50 мл	Научный центр Фишера	14-959-49А
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	10437-028 (Английский)
Щипцы премиум для тканей, 1 x 2 зуба 5 дюймов, немецкая сталь	Научный центр Фишера	Тел.: 13-820-074
Тест-полоска для определения уровня глюкозы в моче	Калифорнийская аптека для домашних животных	У-ЦГ100	Или используйте аналогичную тест-полоску для измерения уровня глюкозы в моче/крови
GlutaMAX–1 (100-кратный)	Gibco	35050-061 (Английский)
Инфракрасная нагревательная лампа	Коул Пармер	03057-00	Или используйте аналогичную инфракрасную лампу
Инсулиновый шприц 0,5 мл, U-100 29 G 0,5 in	Бектон Дикинсон	309306
Изофлуран, USP	Пирамал Реанимация	6679401725
Система визуализации IVIS Spectrum in vivo	Перкин Элмер	124262	Инструмент для неинвазивного сбора биолюминесцентных изображений трансплантированных клеток
Программное обеспечение для анализа живых изображений	Перкин Элмер	128113	Программное обеспечение для сбора и количественного определения биолюминесцентного сигнала
Микроцентрифужные пробирки seal-rite, 1,5 мл	США Сайентифик	1615-5510	Или использовать аналогичные стерильные микроцентрифужные пробирки
НИТ-1	АТКС	ЦРЛ-2055	Бета-клеточная линия поджелудочной железы, полученная от мышей NOD/Lt
кивок. Cg-Prkdcscid/J	Лаборатория Джексона	1303	Мыши, гомозиготные по тяжелой комбинированной иммунодефицитной спонтанной мутации Prkdcscid, обычно называемой scid, характеризуются отсутствием функциональных Т-клеток и В-клеток, лимфопенией, гипогаммаглобулинемией и нормальным кроветворным микроокружением.
NOD/ShiLtJ	Лаборатория Джексона	1976 г	Мышиная линия NOD/ShiLtJ (обычно называемая NOD) является полигенной моделью аутоиммунного диабета 1 типа
PBS, pH 7,4	Thermo Fisher Scientific	10010031	Без кальция, без магния, без фенола красного
pCMV-VSV-G	Адджен	8454
пленти-люцифераза-бласт	Сделано на собственном предприятии	Плазмид по запросу	Смотрите дополнительный файл 1
pMD2.G	Адджен	No 12259
pMDLg/pRRE	Адджен	No 12251
Полиэтиленимин, линейный, MW 25,000, трансфекционный класс (PEI 25K)	Научный центр Фишера	NC1014320
pRSV-Rev	Адджен	No 12253
Ограничитель для грызунов, брум-стиль круглый 1 в	Научный центр Фишера	01-288-32А
Ножницы остроконечные	Научный центр Фишера	08-940 (Английский	Или используйте другие ножницы из хирургической нержавеющей стали
Чашки для культивирования, обработанные тканевой культурой	Миллипора Сигма	CLS430167-20 шт.	Или используйте другие стерильные чашки Петри, обработанные культурами клеток
Пинцет/щипцы, тонкопрецизионные со средним наконечником	Научный центр Фишера	Тел.: 12-000-157