Внутрикожная иммунизация живыми аттенуированными спорозоитами на мышиной модели

Аннотация

Источник: Mac-Daniel, L., et al. Выделение миелоидных клеток из кожи мыши и дренирующего лимфатического узла после внутрикожной иммунизации живыми аттенуированными спорозоитами Plasmodium. J. Vis. Exp. (2016).

Это видео демонстрирует анализ для иммунизации модели мыши живыми аттенуированными спорозоитами. Ослабленные радиацией спорозоиты Plasmodium вводятся в дорсальную сторону уха мыши. После инъекций в несколько мест на обоих ушах мышь может восстановиться.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Материалы и реактивы

1. Используйте самок комаров Anopheles stephensi (штамм Sda500), которые питаются инфицированными мышами через 3-5 дней после появления и выращивают, как описано ранее.
2. Используйте клон ANKA паразитов Plasmodium berghei, экспрессирующий ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) под контролем конститутивного промотора белка теплового шока 70 (HSP70). Это дает яркую флуоресценцию на протяжении всего жизненного цикла паразита.
3. Используйте мышей C57BL/6JRj (7 недель).
   заметка: Все реагенты, используемые в описанном протоколе, перечислены в Таблицематериалов/оборудования.

2. Радиационно-ослабленное выделение спорозоитов из слюнных желез комаров

1. В период между 18-25 днями после приема пищи с инфекционной кровью соберите и обезболите комаров холодом в пробирку объемом 15 мл на льду, как описано ранее. Осторожно переложите их на чашку Петри, перевернув трубку. Держите насекомых на льду и подвергайте комаров дозе γ или рентгеновского облучения в 12 крад.
2. Выделите ослабленные спорозоиты из облученных слюнных желез комаров, как описано ранее. Соберите инфицированные слюнные железы в небольшом объеме (около 15 мкл) 1x фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS) на лед и аккуратно измельчите их, чтобы высвободить спорозоиты.
   заметка: Введение высококонцентрированной суспензии паразита в небольшом объеме имеет решающее значение, поэтому важно собрать достаточное количество слюнных желез у большого числа предварительно отобранных хорошо инфицированных комаров, о чем свидетельствует их сильная экспрессия зеленой флуоресценции.
3. Отфильтруйте суспензию спорозоита через крышку клеточного фильтра размером 35 мкм, адаптированную к микроцентрифужной пробирке с низкой адгезией объемом 1,5 мл, чтобы удалить комки и комары.
4. Подсчитайте общее количество выделенных спорозоитов, как описано ранее, и отрегулируйте концентрацию суспензии паразитов с холодом 1x DPBS для получения 83 000 спорозоитов/мкл. Храните паразитов на льду, продолжая следующие шаги.
5. Соберите эквивалентное количество слюнных желез у неинфицированных комаров, которые будут использоваться в качестве отрицательного контроля, и обработайте образец, как описано в шагах 2.2 и 2.3. Разбавьте образец, как указано выше, чтобы получить аналогичную концентрацию экстрактов слюнных желез в суспензии><. заметка: Спорозоиты могут храниться на льду не более 2 часов. Однако в идеале их вводят в течение часа после раздавливания слюнных желез.

3. Инъекция спорозоитов в дермальный слой уха

1. Обезболивание животных путем внутрибрюшинного введения смеси кетамина (50 мг/кг)/ксилазина (5 мг/кг). Подождите 5-8 минут, пока мышь не войдет в бессознательное состояние, и нанесите на глаза офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить высыхание роговицы. Оцените глубину анестезии, выполнив легкое сжатие пальцев обеих задних ног.
   заметка: Доза анестезии длится менее 20 минут, поэтому следующие шаги должны быть выполнены быстро.
2. Стабилизируйте ушную раковину мыши, зафиксировав брюшную сторону прозрачной лентой, предварительно помещенной под стереомикроскоп (рисунок 1А). Аккуратно надавите на ухо, чтобы избежать повреждения сосудистой сети.
3. Загрузите шприц объемом 10 μл/иглу 35 калибра со скошенной линией 0,6 μл ресуспендированных паразитов.
4. Вводите суспензию спорозоита в 4 местах инъекции (0,15 мкл на место), осторожно вводя иглу на тыльной стороне уха (рис. 1A), ниже эпидермиса, скосом вверх, стараясь избегать попадания кровеносных сосудов. Дайте игле оставаться в дерме в течение нескольких секунд, чтобы предотвратить обратный поток инъекционного средства, прежде чем удалить его. Наблюдайте характерную папулу в каждом месте инъекции в конце процедуры (рис. 1В и 1В).
5. После инъекции аккуратно снимите ухо с ленты.
6. Введите в контралатеральное ухо ту же дозу паразитов, выполнив шаги 3.2-3.4.
7. Введите еще 2 мышам либо 0,6 мкл 1x DPBS, либо 0,6 мкл 1x DPBS + экстракт слюнных желез от неинфицированных комаров, чтобы оценить воспалительную реакцию, опосредованную только инъекцией, и отложение комарного материала в дерме.
8. Следите за восстановлением мыши после анестезии, прежде чем поместить ее обратно в клетку.
   заметка: Надлежащее отложение спорозоитов в коже можно контролировать с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 2А и 2В), при этом мышь подготавливается, как описано выше.

Результаты

Рисунок 1: Введение спорозоитов в ухо мыши. (A) Изображение, показывающее внутрикожное введение спорозоитов в ушную раковину мыши, находящейся под наркозом. Вентральная сторона уха стабилизируется с помощью прозрачной ленты, предварительно помещенной под препарирующий микроскоп. Игла осторожно вводится на тыльной стороне уха, под эпидермисом, скосом вверх. (В...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Кетамин: Ималген® 1000	Мериал	- T	- T
Ксилазин: Ромпун® 2%	Байер	- T	- T
Шприц NanoFil + игла 35 калибра	Мировые прецизионные приборы	- T	- T
Omnican® 50 Инсулиновый шприц 0,5 мл/50 МЕ	Б. Браун Медикал	9151125	- T
Планшет для культивирования тканей MultiwellTM на 6 лунок – плоское дно	BD Falcon	353046	- T
Сетчатый фильтр 70 μм	BD Falcon	No 352350 (Английский	- T
Шприц 2 мл	Терумо	СС-02С	- T
BLUE MAXTM 15мл Полипропиленовая коническая трубка	BD Falcon	352097	- T
BLUE MAXTM 50мл Полипропиленовая коническая трубка	BD Falcon	352098	- T
Полистирольная трубка с круглым дном 5 мл с крышкой клеточного фильтра 35 мкм	BD Falcon	352235	- T
DPBS 1X Cacl2- и MgCl2-free	Технологии Life	14190-094	- T
DMEM 1X + GlutaMAXTM	Технологии Life	31966-021	- T
Дезоксирибонуклеаза I из поджелудочной железы крупного рогатого скота IV типа	Сигма-Олдрич	Д5025	50 мкг/мл
Самки мышей C57BL/6JRj (7 недель)	Лаборатории Жанвье	- T	- T

)