1. Культивирование человеческих иПСК (ИПСК) на эмбриональных фибробластах мыши (MEF)
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные методы культивирования ИПСК также могут быть использованы, включая, но не ограничиваясь, посевом на 6-луночный планшет, предварительно покрытый желатином, студенистой белковой смесью, рекомбинантным ламинином 511 или любым другим внеклеточным матриксом, используемым для экспансии ИПСК, и культивированием с использованием определенных сред, специально разработанных для культуры плюрипотентных стволовых клеток человека.
- Культивирование MEF
- Смажьте 10-сантиметровую клеточную культуру чашкой Петри с 4 мл 0,1% желатина и инкубируйте в течение 30 мин при 37 °C.
- Быстро разморозьте флакон с 4 x 106 облученными MEF до 10 мл среды MEF при температуре 37 °C (модифицированная среда Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] + 10% фетальная бычья сыворотка (FBS) + 1x пенициллин-стрептомицин + 1x добавка L-глутамина). Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Отсадите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 9 мл среды MEF.
- Выньте покрытую желатином посуду из инкубатора. Аспиратируйте желатин и добавьте 7 мл среды MEF. Нанесите 3 мл суспензии MEF (из шага 1.1.2) на посуду, покрытую желатином. Покачивайте тарелку из стороны в сторону и спереди назад, чтобы обеспечить равномерное распределение MEF по тарелке. Выдерживать при 37 °C в течение 8-36 часов.
- Прохождение hiPSC на MEF
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные были получены с использованием антигена меланомы, распознаваемого Т-клетками 1 (MART-1) iPSC, полученного из долгосрочно культивируемого лимфоцита, инфильтрирующего опухоль меланомы (TIL), который специфически распознает пептид MART-1 в контексте человеческого лейкоцитарного антигена (HLA)-A*02:01.
- Пассаж ИПСК при длине колонии от 0,8 до 1,2 мм в диаметре. Перед сдачей необходимо проверить колонии ИПСК в стереомикроскопе и удалить любые участки дифференцировки от культуры с помощью пластикового края наконечника объемом 200 мкл.
- Аспиратируйте отработанные среды и добавьте 10 мл среды hiPSC (питательные среды для эмбриональных стволовых клеток человека [ES] [Таблица материалов] + 10 нг/мл основного фактора роста фибробластов человека [hbFGF]) с добавлением 10 мкМ ингибитора Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK).
- Держите чашку для клеточной культуры в одной руке и прокатите одноразовым инструментом для пропускания клеток по всей чашке в одном направлении. Приложите достаточное давление, чтобы вся лопасть ролика касалась чашки для культуры и поддерживала равномерное давление во время раскатывания.
- Поверните чашку для культуры на 90° и повторите шаг 1.2.3. Рассмотрите пластину в микроскоп, чтобы визуально убедиться в правильности среза колоний, которые должны казаться клетчатыми. Отделите отрезанные колонии путем щадящей механической промывки с помощью пипетки объемом 200 μл.
заметка: Отделение срезанных колоний путем механической промывки должно быть выполнено сразу после нарезки колоний валиком, потому что через 3 минуты срезанные колонии начнут снова прикрепляться к блюду, и отделить колонии однородного размера путем промывки станет затруднительно.
- Переложите 350 - 600 пучков срезанных колоний в новую 10-сантиметровую чашку MEF (покрытую за 8 - 36 ч до пассажа hiPSC) с 10 мл свежей среды hiPSC с добавлением 10 μМ ингибитора ROCK. Инкубировать при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: 600 скоплений представляют собой примерно 1,0 x 106 MART-1 iPSC и дадут 0,5-1,0 x 106 DP клеток на 35-й день. Однако ожидаемые цифры будут варьироваться в зависимости от активности исходной клеточной линии и условий культивирования.
- На следующий день отсадите отработанную среду и добавьте 10 мл свежей среды hiPSC. Меняйте среду гиПСК каждые 1-2 дня, в зависимости от скорости роста гиПСК.
2. Подготовка клеток OP9/DLL1 к ко-культуре с иПСК
- Культивирование клеток OP9/DLL1 в средах OP9 [α-минимальная эфирная среда (α-MEM) + 20% фетальная бычья сыворотка (FBS) + 1x пенициллин-стрептомицин] при 37 °C. Когда клетки OP9/DLL1 достигают конфлюенции, аспирируйте среду и промойте один раз 5 мл 1x магния, кальция и фенола красного свободного фосфат-буферного раствора (PBS).
- Аспиратуйте PBS и добавьте 2 мл 0,05% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Выдерживать в течение 5 минут при 37 °C. Затем добавьте 4 мл среды OP9 и механически диссоциируйте клеточный слой с помощью пипетирования, чтобы получить одноклеточную суспензию.
- Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл через клеточный фильтр 100 мкм, чтобы избежать образования клеточных комков. Центрифугировать при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Отсадить надосадочную жидкость и ресуспендировать в 12 мл среды OP9.
- Добавьте 8 мл среды OP9 в шесть новых 10-сантиметровых чашек Петри для клеточной культуры. Положите 2 мл суспензии клеток OP9/DLL1 с шага 2.3 на каждую новую чашку диаметром 10 см. Покачивайте тарелку из стороны в сторону, а затем спереди назад, чтобы обеспечить равномерное распределение OP9/DLL1 по тарелке.
- Инкубировать при температуре 37 °C. Повторять пассаж каждые 2 - 3 дня, когда клетки достигнут слияния.
заметка: Важно сделать достаточное количество замороженных клеток OP9/DLL1 и размораживать новый запас каждые 4-6 недель.
3. Дифференцировка ИПСК in vitro в CD8αβ+ одиночные положительные (SP) Т-клетки
- Приготовьте желатинизированные блюда OP9/DLL1 за неделю до совместного культивирования с гиПСК. Для приготовления 0,1% раствора желатина добавьте 5 мл тканевого раствора желатина комнатной температуры (RT) к 500 мл PBS.
- Покройте 3 новые 10 см клеточной культуры чашки Петри, добавив 4 мл на каждую чашку 0,1% желатина. Инкубировать 30 минут при 37 °C.
- Аспиратируйте желатин и добавьте в каждую посуду по 8 мл среды OP9. Пропустите одну сливающуюся чашку OP9/DLL1 (как сделано в разделе 2 выше) в три чашки, предварительно покрытые желатином.
- Через 4 дня добавьте по 10 мл среды OP9 в каждую 10-сантиметровую чашку OP9/DLL1 на желатине на 20 мл среды на чашку.
- Через 7 - 8 дней начните совместное культивирование hiPSC на конфлюентных чашках OP9/DLL1 (день дифференцировки 0).
- Аспират отработанной среды из сливающейся 10-сантиметровой чашки ИПСК на МЭФ. Добавьте 10 мл среды OP9. Вырежьте и отделите колонии hiPSC с помощью одноразового инструмента для пассирования клеток, как это сделано в шагах 1.2.3 и 1.2.4.
- Переложите 350–600 пучков нарезанных колоний на предварительно желатинизированную чашку OP9/DLL1 диаметром 10 см (шаг 3.1) с 10 мл свежей среды OP9 с помощью пипетки объемом 200 μл. Покачивайте тарелку для культуры из стороны в сторону, а затем спереди назад, чтобы обеспечить равномерное распределение колоний.
заметка: В качестве альтернативы можно использовать предварительно сформированные эмбриоидные тельца (БЭ) ИПСК или небольшие комковатые суспензии. Тем не менее, использование одноразового инструмента для пропускания клеток или системы формирования БЭ предпочтительно для получения скоплений иПСК одинакового размера.
- В 1-й день аспирируйте отработанную среду и замените ее 20 мл свежей среды OP9. Комки hiPSC, совместно культивируемые на OP9/DLL1 в течение 1 дня, будут выглядеть как небольшие круглые монослойные колонии (рис. 1).
- На 5-й день аспирируйте 10 мл отработанной среды и добавьте 10 мл свежей среды OP9. Колонии иПСК начнут дифференцироваться в примитивную мезодерму, характеризующуюся многослойным темным центром.
- На 9-й день аспирируйте 10 мл отработанной среды и добавьте 10 мл свежей среды OP9. На этом этапе многослойные центральные структуры превратятся в куполообразные формы, и станет очевидной периферийная область, похожая на сеть.
- На 13-й день соберите гемопоэтические клетки-предшественники (ГПК) (Рисунок 1). Структуры, полученные из ИПСК на 13-й день, характеризуются темным центральным органоидом, окруженным сетью куполообразных областей, представляющих гемопоэтические зоны (ОГ), которые, как сообщалось ранее, заключают в себе гемопоэтических предшественников, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие куполообразных структур указывает на успешный процесс даже при отсутствии темных центров. Невозможность получения HPC может быть связана с низким качеством OP9/DLL1, качеством партии FBS, слиянием скоплений iPSC, засеянных на OP9/DLL1 (оптимально 350-600 скоплений) и/или вариациями в эффективности линий iPSC для производства гемопоэтических предшественников.
- Отсадите отработанную среду и промойте 1x 5 мл 1x фенола без красных сбалансированного раствора соли Ганкса, модифицированного кальцием и магнием (HBSS).
- Аспиратируйте HBSS и добавьте 250 мкл 5000 ЕД/мл коллагеназы IV в 10 мл HBSS. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 45 минут. Аспиратуйте HBSS коллагеназой внутривенно и промывайтесь один раз 5 мл PBS.
- Асасируйте PBS и добавьте 5 мл 0,25% трипсина-ЭДТА. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 20 минут. Затем добавьте 4 мл среды OP9 и диссоциируйте клеточный слой с помощью пипетирования, чтобы получить одноклеточную суспензию.
- Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл через клеточный фильтр 100 мкм. Центрифугировать при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Отсадить надосадочную жидкость и ресуспондировать в 10 мл среды OP9.
- Суспензию пластинчатых клеток на новую желатинизированную 10-сантиметровую чашку Петри для клеточной культуры (см. шаги 3.1.1 и 3.1.2). Выдерживать при температуре 37 °C в течение 45 минут. Затем соберите неадгезивные клетки с помощью аккуратного пипетирования.
- Перенесите собранную клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл через клеточный фильтр 100 мкм. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте в 10 мл дифференцировочной среды [среда OP9 с фактором стволовых клеток человека 5 нг/мл (hSCF), 5 нг/мл человеческого Flt3-лиганда (hFLT3L) и 5 нг/мл человеческого интерлейкина 7 (hIL-7)].
- Поместите клеточную суспензию на новую 10-сантиметровую чашку OP9/DLL1.
- На 16 день пройдите по клеткам.
- Механически отделите неадгезивные клетки с помощью щадящего пипетирования и отфильтруйте через сетчатый фильтр 100 мкм. Центрифугировать при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Аспирировать надосадочную жидкость и ресуспендировать в дифференцировочной среде объемом 10 мл.
- Поместите клеточную суспензию на новую 10-сантиметровую чашку OP9/DLL1.
- Продолжайте пассировать неадгезивные клетки каждые 5-7 дней после этого, повторяя шаг 3.8.
- На 35-й день обогащайте CD4+CD8+ двойную положительную (DP) популяцию и стимулируйте выработку CD8αβ+ одиночных положительных (SP) Т-клеток (Рисунок 2).
- Механически отделите неадгезивные клетки путем аккуратного пипетирования и фильтрации через сетчатый фильтр 100 мкм для удаления комков. Обогащение популяции клеток CD4+ путем выделения магнитных шариков CD4 в соответствии с протоколом производителя.
заметка: Обоснованием использования магнитных гранул CD4 является удаление CD4-CD8- двойных негативных (DN) клеток из культуры, поскольку было продемонстрировано, что они вызывают прямое уничтожение CD4+CD8+ DP-клеток после стимуляции.
- Подсчитайте живые клетки, обогащенные CD4, с помощью гемоцитометра Neubauer и синего красителя Trypan. Суспендировать в средах OP9 в общей концентрации 0,5 x 106 клеток/мл. Аликвоту 1 мл клеточной суспензии (0,5 х 106 клеток) в каждую лунку тканевой культуры с плоским дном 24 здоровых планшетов сливающегося OP9/DLL1.
- Добавьте 100 МЕ человеческого интерлейкина 2 (hIL-2), 5 нг/мл hIL-7, 500 нг/мл антитела против человеческого CD3 и 2 мкг/мл антитела против человеческого CD28, затем культивируйте при 37 °C.
