Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Приготовление блюд для кормления клеток глии (за 2 недели до дня культуры)
- Препарируйте кору головного мозга мыши в постнатальном возрасте 1 дня и снимите мозговые оболочки.
- Разрежьте ткань коры как можно мельче чистыми ножницами в чистой чашке Петри на чистой скамейке.
- Перенесите измельченную ткань в 12 мл HBSS и добавьте 1,5 мл 2,5% трипсина и 1% (масс./об.) ДНКазы. Выдерживать на водяной бане 37 °C в течение 15 минут, качать каждые 5 минут. Хорошо переваренная ткань становится липкой и образует большое скопление. Растирайте 10-15 раз с помощью пипетки объемом 10 мл, чтобы разрушить ткань и улучшить пищеварение.
- Растирайте хорошо переваренную ткань 10-15 раз с помощью пипетки объемом 5 мл до тех пор, пока большинство кусков не исчезнет, а среда не помутнеет. Пропустите через клеточное ситечко, чтобы удалить оставшиеся кусочки, и добавьте 15 мл глиевой среды (минимальная эфирная среда (MEM) с добавлением глюкозы (0,6% масс./об.), 10% (об/об.) лошадиной сыворотки и пенициллин-стрептомицина (1x) для остановки пищеварения.
- Центрифугируйте клетки при давлении 120 x g в течение 5 минут и аспирируйте надосадочную жидкость. Суспендировать клеточную гранулу свежей глиевой средой и семенами в чашках для клеточных культур (около 105 клеток/см2 ).
- Замените среду свежей глией на следующий день, чтобы удалить неприкрепленные клетки.
- Подкармливайте блюда из глии раз в 3-4 дня свежей глией средней. Хлопните по колбе 5-10 раз рукой, чтобы выбить слабо прикрепленные ячейки, прежде чем менять среду.
- После 10 дней культивирования глиальные клетки должны быть почти сливающимися. Отделите клетки глии с 0,25% трипсин-ЭДТА и засейте около 105 клеток в новую 60-миллиметровую чашку для культивирования клеток. Оставшиеся элементы могут быть заморожены для дальнейшего использования.
- За 3 дня до дня посева смените среду для глии на среду для культуры нейронов (Нейробазальная-А среда с 1x GlutaMAX-I и 1x добавкой B27)
2. Культура нейронов гиппокампа
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги выполняются при комнатной температуре.
- Препарируйте 6-8 гиппокампов от постнатальных 1-дневных щенков мышей ANK3-E22/23f/f средой HBSS в чашке Петри при комнатной температуре. Разрежьте гиппокамп ножницами для пресечения на более мелкие кусочки. Переложите гиппокамп из чашки Петри в пробирку объемом 15 мл.
- Промойте гиппокамп 2x с 5 мл HBSS в тюбике. Оставьте гиппокамп в 4,5 мл 1x HBSS после умывания.
- Добавьте 0,5 мл 2,5% трипсина в 4,5 мл HBSS и инкубируйте на водяной бане при температуре 37 °C в течение 15 минут. Переворачивайте трубку каждые 5 минут. Хорошо переваренный гиппокамп должен стать липким и образовать скопление. При необходимости продлите варение еще на 5 минут.
- Промойте гиппокамп HBSS 3 раза по 5 минут каждый. Не используйте пылесос для извлечения HBSS. Он очень легко снимает гиппокамп.
- Добавьте 2 мл HBSS после промывания и проведите пипеткой гиппокамп вверх и вниз с помощью пипетки Пастера 15 раз.
- Растирать ткань отполированной огнем пастеровской пипеткой (диаметр открытого отверстия сужается вдвое) 10 раз. Не превышайте 10 раз, даже если еще остались куски. Чрезмерное сдвигание убивает нейроны.
- Оставьте трубку на 5 минут, пока все куски не опустятся на дно. Осторожно с помощью наконечника пипетки объемом 1 мл перенесите надосадочную жидкость, содержащую диссоциированные нейроны, в тарелки (чашка10 5 клеток/60 мм). Добавьте его непосредственно в предварительно инкубированную среду для сервировки и осторожно встряхните тарелку.
- Повторяйте шаги 2.6-2.7 с оставшимися чанками до тех пор, пока большая часть чанков не исчезнет.
- Через 2-4 часа после посева проверьте облицовку посуды световым микроскопом. Большинство нейронов должны быть прикреплены к покровному листу. Прикрепленные ячейки круглые и яркие. С помощью щипцов с тонким наконечником переверните покровные листы на чашки питателя клеток глии с предварительно подготовленной питательной средой нейронов стороной восковых точек вниз.
- Нейроны могут расти в кормушках для клеток глии до 1 месяца. Подкармливайте нейроны каждые 7 дней 1 мл свежей питательной среды для нейронов.
- Необязательный шаг: через 1 неделю после посева добавьте цитозин арабинозид (1-β-D-арабинофуранозилцитозин) до конечной концентрации 5 мкМ для ограничения глиальной пролиферации.
