Создание культуры первичных нейронов низкой плотности из замороженных эмбриональных нейронов

Аннотация

Источник: Koganezawa, N. et al., Простая и воспроизводимая первичная культура низкой плотности с использованием замороженного запаса эмбриональных нейронов гиппокампа.J. Vis. Exp. (2023)

Это видео демонстрирует метод культивирования криоконсервированных эмбриональных нейронов, включающий контролируемое размораживание, разведение нейробазальной средой и посев на пластину, покрытую поли-L-лизином. Последующая инкубация поддерживает рост и поддержание нейронных связей.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Покрытие плит

1. Покройте 96-луночный микропланшет поли-L-лизином (1 мг/мл, разведенный в 0,1 М боратном буфере [pH: 8,5]; 100 μл/лунку) и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
   заметка: Замазывайте только те лунки, которые необходимо использовать. В проводимых здесь экспериментах используются средние 60 скважин. Боратный буфер получают путем смешивания 50 мМ борной кислоты и 12 мМ бората в стерилизованной воде.
2. Дважды промойте тарелку стерилизованной водой (250 μл/лунка).
3. Один раз промыть пластину свежей питательной средой без добавок (250 μл/лунка).
4. Просушите тарелку на чистой скамейке в течение 20 минут.
5. Оберните тарелку алюминиевой фольгой и держите при температуре 4 °C до использования (срок действия 1 месяц).

2. Посев клеток

1. Добавьте 50 μл/лунку питательной среды в покрытую покрытием пластину и выдержите ее в инкубаторе с температурой 37 °C, 5%_CO2 от 30 мин до 1 ч. Заполните периферийные лунки стерилизованной водой (200 мкл/лунка). <бр/> заметка: Питательную среду готовят путем добавления 50-кратного В-27, 400-кратного глутамакса и 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина в нейробазальную среду (подробнее см. в Таблице материалов).
2. Извлеките нейрон криовиальным из резервуара с жидким азотом. Здесь использовались диметилсульфоксид-криоконсервированные (ДМСО-криоконсервированные) нейроны.
3. Погрузите криовиал в термоблок при температуре 37 °C на срок до 3 минут и частично разморозьте содержимое. Не прогревайте криовиал слишком долго. Переложите содержимое в пробирку объемом 50 мл, как только она оттает.
4. Медленно перенесите криовиальное содержимое нейрона в стерильную пробирку объемом 50 мл (50 мкл/с) по каплям (50 мкл/с) с помощью пипетки объемом 1 мл с широкопористым наконечником.
5. Промойте пустой криовиал 1 мл питательной среды (комнатной температуры; RT). Перенесите этот 1 мл питательной среды из криовиальной капли (50 мкл/с) в 50 мл пробирки, содержащей клеточную суспензию.
6. Добавьте 9 мл питательной среды (ОТ) в 50 мл пробирки по каплям (0,5 мл/с) и доведите объем до 11 мл. Не повторяйте пипетирование, а медленно перемешивайте клеточную суспензию.
7. Посчитайте количество клеток (используйте счетчик клеток или гемоцитометр).
8. Перенесите всю клеточную суспензию в резервуар и дозируйте клеточную суспензию на 96-луночный планшет с помощью многоканальной пипетки с широкими порами (1,0 x 10,⁴ ячейки/лунка). Чтобы уменьшить испарение питательной среды, заполните периферийные лунки стерилизованной водой (шаг 2.1). <бр/> заметка: Данное исследование подтверждает, что испарение питательной среды невелико для 3-недельной культуры без обмена среды. Норма восстановления среды составляет 3,6% (n = 120 скважин). Таким образом, изменение осмоляльности не будет резким в течение 3-недельного инкубационного периода.
9. Инкубируйте нейроны в течение 1-2 часов в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%_CO2.
10. Замените питательную среду 100 μл предварительно подогретой питательной среды (37 °C) на лунку и поместите ее обратно в инкубатор с температурой 37 °C и 5%_CO2 (во время культивирования не требуется менять среду).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Планшет на 96 лунок	Корпорация Zeon		одаренный
Планшет на 96 лунок	Грейнер	655986
В-27	Gibco	17504-044	2 v/v% для планшетов MEA; 50x для обычных планшетов
бура	сигма	В-9876	Конечная концентрация 12 мМ
борная кислота	ВАКО	021-02195 (Английский)	Конечная концентрация 50 мМ
Бычий сывороточный альбумин	Многородность	12659-100Г	Конечная концентрация: 3% в PBS
ГлутаМАКС	Gibco	35050-061 (Английский)	2,5 мМ для планшетов MEA; 400x для обычных планшетов
Анализатор в клетках 2200	Цитива		Флуоресцентные изображения
Нейробазальный	Gibco	No 21103-049
Пенициллин/стрептомицин	Gibco	15140-122	100 Ед/мл для обычных планшетов
Пенициллин/стрептомицин	Накалай Теске	No 26253-84	100 г/мл для планшетов MEA
Поли-L-лизин	сигма	П2636	Разведенный в боратном буфере (конечная концентрация: 1 мг/мл)
SKY Neuron	AlzMed, Inc.	АРХ001	1,0 x 106 ячеек/трубка